多重修飾DNAライブラリを用いた応用インビトロ・セレクション法の開発

• Project/Area Number: 17710179
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Living organism molecular science
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 桑原 正靖 Gunma University, 大学院・工学研究科, 助教 (40334130)
• Project Period (FY): 2005 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2007: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2006: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2005: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 核酸 / 有機化学 / バイオテクノロジー / 生体生命情報学

Research Abstract

酵素や抗体と類似の機能をもつDRA(機能性DNA)は、インビトロ・セレクション法によって創製することができる。機能性DNAの特異的分子認識能を利用して、基礎生物学の研究ツールや医薬品などへの応用が期待されている。DNAは化学的に安定で変性し難い性質をもち、且つ、化学合成やポリメラーゼによって比較的容易に調製できるので、耐久性やコストなどの点において優れている反面、DNAには活性が低いという大きな欠点がある。本研究ではこのような機能性DNAの活性の向上や多様性の拡張を指向して、酵素や抗体の活性残基などを導入した修飾DNAライブラリを用いた応用インビトロ・セレクション法の開発を試みた。これまでの研究で、ポリメラーゼによる修飾ヌクレオチドのDNAへの取り込み効率は、修飾基の化学構造に大きく依存していることを明らかにしている。即ち、ライブラリの調製に必要なDNAポリメラーゼの基質特異性によって、DNAに同時に効率よく導入できる機能基の種類数は制約される。そこで、導入効率の良い酵素-修飾基質三リン酸の組み合わせを探し、それらを用いて、3種類の機能基を導入した多重修飾DNAライブラリの構築を検討したところ、5位置換ピリミジンヌクレオシド三リン酸および7デアザアデノシンヌクレオシド三リン酸を基質とし、KOD Dash DNAポリメラーゼを触媒としたプライマー伸長反応により高密度に修飾基が導入された修飾DNA分子の生成が確認された。さらに、ピリジンを修飾したdUTPおよびdATPのアナログを合成し、弱塩基を高密度に有する修飾DNAのライブラリを作製することにより、多重修飾DNAをライブラリとするインビトロ・セレクション系を構築することに成功した。

Research Products

• [Journal Article] Arginine-modified DNA Aptamers That Show Enantioselective Recognition of the Dicarboxylic Acid Moiety of Glutamic Acid (2008)
  • Author(s): Kazuomi Ohsawa, Toshiyuki Kasamatsu, Jun-ichi Nagashima, Kazuo Hanawa, Masayasu Kuwahara, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Analytical Sciences 24,(1) Pages: 167-172
  • NAID: 10020143849
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differences in substrate specificity of C(5)-substituted or C(5)-unsubstituted pyrimidinenucleotides by DNA polymerases from thermophilic bacteria, archaea, and phages (2007)
  • Author(s): Hiroaki Sawai, Jun-ichi Nagashima, Masayasu Kuwahara, Rina Kitagata, Takehiro Tamura, Ikuo Matsui
  • Journal Title: Chemistry & Biodiversity 4,(9) Pages: 1979-1995
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A modified DNA aptamer that binds the(R)-isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. (2007)
  • Author(s): Atsushi Shoji, Masayasu Kuwahara, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society 129,(5) Pages: 1456-1464
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Polymerisation of a DNA strand using oligo-DNA template with modified bases, sugars and phosphates (2007)
  • Author(s): Jun-ichi Nagashima, Satoshi Minezaki, Satoshi Obika, Takeshi Imanishi, Masayasu Kuwahara and Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Nucleic Acids Symposium Series 51 Pages: 55-56
• [Journal Article] Substrate property and incorporation accuracy of various dATP analogs during enzymatic polymerization using thermostable DNA polymerases (2006)
  • Author(s): Masayasu Kuwahara, Yosshiyuki Suto, Satoshi Minezaki, Rina Kitagata, Jun-ichi Nagashima, Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp.Ser. 50 Pages: 31-32
• [Journal Article] Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids found in proteins : convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. (2006)
  • Author(s): Masayasu Kuwahara, Kazuo Hanawa, Kazuomi Ohsawa, Rina Kitagata, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry 14,(8) Pages: 2518-2526
• [Presentation] 主鎖骨格修飾ヌクレオチドを含むDNA鋳型鎖を用いたポリメラーゼ反応 (2008)
  • Author(s): 永島潤一・峯崎賢巳・桑原正靖・尾崎広明・澤井宏明
  • Organizer: 日本化学会 第88回春季年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2008-03-28
• [Presentation] DNAの二次構造を認識する修飾DNAアプタマーの最小化とその機能評価 (2008)
  • Author(s): 桑原正靖・森角裕平・笠松敏幸・尾崎広明・澤井宏明
  • Organizer: 日本化学会 第88回春季年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2008-03-28
• [Presentation] DNAの主鎖リン酸部位の改変がポリメラーゼ反応に及ぼす影響 (2008)
  • Author(s): 永島潤一, 峯崎賢巳, 桑原正靖, 尾崎広明, 澤井宏明
  • Organizer: 第10回生命化学研究会シンポジウム
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 2008-01-11
• [Presentation] 人工核酸分子の可能性〜核酸医薬・診断薬の創製をめざして (2007)
  • Author(s): 桑原正靖
  • Organizer: 第22回 生体機能関連化学シンポジウム「若手フォーラム」
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2007-09-30
• [Presentation] DNAポリメラーゼによる主鎖骨格修飾鋳型鎖の配列読取り (2007)
  • Author(s): 峯崎賢巳, 永島潤一;桑原正靖, 尾崎広明, 澤井宏明
  • Organizer: 第22回生体機能関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2007-09-29
• [Patent(Industrial Property Rights)] 新規核酸誘導体及びそれを用いたポリヌクレオチドの製造方法 (2005)
  • Inventor(s): 桑原正靖, 澤井宏明
  • Industrial Property Rights Holder: 群馬大学
  • Industrial Property Number: 2005-217479
  • Filing Date: 2005-07-27