アプタマーを分子認識素子とした蛍光プローブの創製と細胞内イメージングへの応用

• Project/Area Number: 17750073
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Analytical chemistry
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 宗 伸明 九州大学, 大学院工学研究院, 助手 (90336008)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2006: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2005: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: 蛍光プローブ / アプタマー / アデノシン三リン酸 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / G-カルテット構造

Research Abstract

本年度は、前年度までの結果を基に、プローブデザインを更に改善した新規アプタマー型プローブ、プローブIIIの開発を行った。具体的には、ATP認識DNAアプタマー(apt)(27mer)の5'末端に補足配列(add)(5mer)を付加したDNA(add-apt)に対し、相補的一本鎖DNA(comp)(12mer)をハイブリダイズさせ、add-aptの5'末端にドナー蛍光基、compの3'末端にアクセプター蛍光基を標識したものをプローブIIIとして設計し、その性能について検討した。まず、プローブIIIに対してArpを添加したところ、添加に伴う蛍光強度比I_D/I_A(I_DとI_Aはそれぞれドナー蛍光基とアクセプター蛍光基の蛍光強度)の増大が観測された。これは、Arpの認識に伴いプローブIII中の相補鎖DNAが解離し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が解消されたためであると考えられる。蛍光強度比の変化と添加したArp濃度との間には相関が認められた。また、プローブIIIは、GTP、UTP、CTPには有意な蛍光応答を示さず、優れたヌクレオシド選択性を有していることが明らかとなった。更に、add-aptの3'末端に対して細胞膜透過性ペプチドを結合したプローブをRaw264細胞に適用し、蛍光顕微鏡観察を行ったところ、本プローブが細胞内に良好に導入されている様子を確認することができた。以上の結果から、プロ-ブIIIは新規Arp計測用蛍光プローブとして有用であると考えられ、本研究目標であるアプタマーを分子認識素子とした細胞内導入用蛍光プローブの開発に成功することができた。

Research Products

• [Journal Article] Surface plasmon resonance immunosensor for IgE analysis using two types of anti-IgE antibodies with different active recognition sites (2007)
  • Author(s): Yan Li et al.
  • Journal Title: Anal. Sci. 23巻1号 Pages: 31-38
• [Journal Article] Novel fluorescent probe for detecting hydroperoxides with strong emission in the visible range (2006)
  • Author(s): Nobuaki Soh et al.
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. Lett. 16巻11号 Pages: 2943-2946
• [Journal Article] Electrochemical sandwich immunoassay for vitellogenin by sequential injection analysis using antibody immobilized magnetic microbeads (2006)
  • Author(s): Koji Hirakawa et al.
  • Journal Title: Electroanalysis 18巻13-14号 Pages: 1297-1305
• [Journal Article] Surface plasmon resonance immunosensor for histamine based on an indirect competitive immunoreaction (2006)
  • Author(s): Yan Li et al.
  • Journal Title: Anal. Chim. Acta. 576巻1号 Pages: 77-83
• [Journal Article] Methodology of reversible protein labeling for ratiometric fluorescent measurement (2006)
  • Author(s): Nobuaki Soh et al.
  • Journal Title: Mol. BioSyst. 2巻2号 Pages: 128-131
• [Journal Article] Electrochemical immunoassay for vitellogenin based on sequential injection using antigen-immobilized magnetic microbeads (2006)
  • Author(s): Koji Hirakawa et al.
  • Journal Title: Anal. Sci. 22巻1号 Pages: 81-86
• [Journal Article] Sequential injection chemiluminescence immunoassay for anionic surfactants using magnetic microbeads immobilized with an antibody (2005)
  • Author(s): RuiQi Zhang et al.
  • Journal Title: Talanta 68巻2号 Pages: 231-238
• [Journal Article] Flow immunoassay of trinitrophenol based on surface plasmon resonance sensor using a one-pot immunoreaction with a high molecular weight conjugate (2005)
  • Author(s): Masatoshi Kobayashi et al.
  • Journal Title: Talanta 68巻2号 Pages: 198-206