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生細胞中での蛋白質の部位特異的蛍光標識法の開発

Research Project

Project/Area Number 17750162
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Chemistry related to living body
Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

大槻 高史  岡山大学, 大学院自然科学研究科, 講師 (80321735)

Project Period (FY) 2005 – 2006
Project Status Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2005: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Keywords蛍光アミノ酸 / 蛋白質 / 翻訳 / 哺乳動物細胞 / 非天然アミノ酸 / tRNA / EF-Tu / プロテオーム / 蛋白質生合成 / コドン / 細胞 / 直交化tRNA / 蛍光標識
Research Abstract

細胞内の生体分子の動態や局在などのネットワークを調べることはポストゲノム時代の最重要課題の1つである。この課題を網羅的・効率的に進めるためには、生体分子を可視化させる蛍光標識技術の開発が必要である。蛋白質分子の蛍光標識法としては、目的蛋白質の末端にGFPなど蛍光蛋白質を結合させる方法が現在一般的であるが、大きな蛍光蛋白質を融合することにより目的蛋白質の本来の性質が損なわれる可能性も高い。そこで、蛋白質の機能に極力影響を与えない小さな蛍光基の導入が望まれる。本課題では、細胞内で蛋白質中の望んだ部位に蛍光基を導入する方法を開発することを試みた。本方法は細胞内の蛋白質合成装置を利用し、蛍光基をもつアミノ酸を直交化tRNAに結合させ、mRNA上のコドン特異的に蛋白質に導入するというものである。この方法では、蛍光部位は小さな蛍光基としてアミノ酸一残基分のスペースに導入するため、蛋白質の機能を損なう可能性は少ない。
本年度は、細胞内翻訳装置により蛍光アミノ酸を蛋白質に組み込む方法を検討した。蛍光アミノ酸に対応するコドンとしてアンバーコドンを用い、アンバーコドンを含む蛋白質遺伝子(ここではDsRed遺伝子)を発現ベクターに組み込んで、哺乳動物細胞(ここではCHO細胞)に導入した。その細胞に細胞内のARSによりアミノアシル化されるようなサプレッサーtRNAをリポフェクション法により導入したところ、DsRedの赤色蛍光によりアンバーコドンのサプレッションが観測された。細胞外で蛍光アミノ酸(Bodipy-FL-AF)を結合させたサプレッサーtRNAを用いた場合も、アミノアシルtRNAのエンドソーム経由での細胞内導入が確認された。主にエンドソーム内にアミノアシルtRNAが固まって強い蛍光を放っていたため、これを改善するような導入法を今後さらに検討する。

Report

(2 results)
  • 2006 Annual Research Report
  • 2005 Annual Research Report
  • Research Products

    (9 results)

All 2007 2006 2005

All Journal Article (9 results)

  • [Journal Article] T-armless tRNAs and elongated elongation factor Tu.2007

    • Author(s)
      Ohtsuki, T., Watanabe, Y.
    • Journal Title

      IUBMB life (in press)

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] Design of carrier tRNAs and selection of four-base codons for efficient incorporation of various nonnatural amino acids into proteins in Spodoptera frugiperda 21 (Sf21)insect cell-free translation system2006

    • Author(s)
      Taki, M., Tokuda, Y., Ohtsuki, T., Sisido, M.
    • Journal Title

      J.Biosci.Bioeng. 102

      Pages: 511-517

    • NAID

      110006196944

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] An evolutionary `intermediate state' of mitochondrial translation systems found in Trichinella species of parasitic nematodes : co-evolution of tRNA and EF-Tu.2006

    • Author(s)
      Arita, M., Suematsu, T., Osanai, A., Inaba, T., Kamiya, H., Kita, K., Sisido, M., Watanabe.Y., Ohtsuki, T.
    • Journal Title

      Nucleic Acids Research 34

      Pages: 5291-5299

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] A protein extension to shorten RNA : Elongated elongation factor Tu recognizes the D-arm of T-armless tRNAs in nematode mitochondria.2006

    • Author(s)
      Sakurai, M., Watanabe, Y., Watanabe, K., Ohtsuki, T.
    • Journal Title

      Biochemical Journal 399

      Pages: 249-256

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] Identification of the residues involved in the unique serine specificity of C.elgans mitochondrial EF-Tu2.2006

    • Author(s)
      Sato, A., Watanabe, Y., Suzuki, T., Komiyama, M., Watanabe, K., Ohtsuki, T.
    • Journal Title

      Biochemistry 45

      Pages: 10920-10927

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] 非天然アミノ酸の導入による蛋白質の蛍光ラベル法とその応用2006

    • Author(s)
      宍戸昌彦, 瀧真清, 大槻高史, 芳坂貴弘
    • Journal Title

      蛋白質核酸酵素 51・5

      Pages: 399-407

    • NAID

      40007273470

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  • [Journal Article] Binding efficiency of EF-Tu to tRNAs charged with nonnatural fluorescent amino acids.2006

    • Author(s)
      Nakata, H., Ohtsuki, T., Abe, R., Hohsaka, T., Sisido, M.
    • Journal Title

      Analytical Biochemistry 348

      Pages: 321-323

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    • Author(s)
      Ohtsuki, T., Manabe, T., Sisido, M.
    • Journal Title

      FEBS letters 579

      Pages: 6769-6774

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Four-base condon/anticondon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with nonnatural amino acids.2005

    • Author(s)
      Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T.
    • Journal Title

      Methods 36

      Pages: 270-278

    • Related Report
      2005 Annual Research Report

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Published: 2005-04-01   Modified: 2016-04-21  

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