結晶構造の時間変化からみるオロチジン-リン酸脱炭酸酵素の反応触媒機構

• Project/Area Number: 17770087
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 藤橋 雅宏 Kyoto University, 大学院・理学研究科, 助教 (10397581)
• Project Period (FY): 2005 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2007: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2006: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2005: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: ODCase / OMPDC / OMPDCase / X線結晶構造解析 / 反応機構 / 酵素基質複合体 / 副反応 / ピリミジン新規合成 / 抗分解能X線構造 / 酵素反応 / オロチジン-リン酸脱炭酸酵素 / 抗マラリア剤 / 抗ウイルス剤 / 結晶構造 / 高分解能X線構造 / オロチジン一リン酸脱炭酸酵素 / 抗ウイルス薬

Research Abstract

オロチジンーリン酸脱炭酸酵素の中でも、これまでの研究から比較的很質な結晶を得る条件が明らかとなっているMethanobacterium thermoautotrophicum由来の酵素を用いて研究をすすめた。
反応進行中の酵素の結晶を瞬間凍結し、結晶構造の時間変化を観察することについては、これまでに見いだした、野生形ODCaseが6-cyano-UMPをBMPに変換する系以外にも、結晶内でも進行するいくつかの副反応を見いだした。これらの系について、詳しい解析をすすめた。今までに得た系を統合すると、ODCaseは通常の求核置換様の反応に加えて、いくつかの種類の求電子置換様の反応も触媒することが明らかになった。
中性子回折・超高分解能X線解析については、結晶の質を改善するため、ODCaseのアミノ酸残基のうち、タンパク質間相互作用(すなわち結晶格子の形成)に関わる残基に着目し、部位特異的変異を導入することでより安定な結晶格子を形成できるようにする変異をいくつか導入した。
共同研究先の、Lakshmi P. Kotra准教授らによって合成された基質アナログを用いて、ODCaseとの複合体を作成し、これらと野生型・変異型ODCase複合体の結晶構造解析を、1.2-1.8Å分解能で行った。
以上の知見を基にした、ODCaseの反応触媒機構についでは、現在論文執筆中である。

Research Products

• [Journal Article] A potent, covalent inhibitor of orotidine 5'-monophosphate decarboxylase with antimalarial activity (2007)
  • Author(s): Bello AM, Poduch E, Fujihashi M, et al.
  • Journal Title: J.Med.Chem. 50(5) Pages: 915-921
• [Journal Article] Design of inhibitors of orotidine monophosphate decarboxylase using bioisosteric replacement and determination of inhibition kinetics (2006)
  • Author(s): Poduch E, Bello AM, Tang S, Fujihashi M, Pai EF, Kotra LP
  • Journal Title: J.Med.Chem. 49(16) Pages: 4937-4945
• [Journal Article] An unprecedented twist to ODCase catalytic activity (2005)
  • Author(s): Fujihashi M, Bello AM, Poduch E, Wei L, Annedi SC, Pai EF, Kotra
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society 127(43) Pages: 15048-15050
• [Presentation] ODCaseの反応中間体構造の解析と、その新規不可逆阻害剤の発見 (2007)
  • Author(s): 藤橋雅宏, 他(6人中の1人目)
  • Organizer: 日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 東京工業大学・大岡山キャンパス
  • Year and Date: 2007-12-01
• [Patent(Industrial Property Rights)] Inhibitors of orotidine monophosphate decarboxylase (ODCase) activity (2005)
  • Inventor(s): Kotra, L.P., Pal, E.F., Belb, A.M., Fujihashi, M., Poduch, E.
  • Industrial Property Rights Holder: Kotra, L.P., Pal, E.F., Belb, A.M., Fujihashi, M., Poduch, E.
  • Filing Date: 2005-10-03