| Project/Area Number |
17770124
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Biophysics
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
権田 幸祐 東北大学, 先進医工学研究機構, 助手 (80375435)
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| Project Period (FY) |
2005 – 2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Fiscal Year 2006: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2005: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
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| Keywords | Centrin / 電位依存性Ca^<2+>チャンネル / Ca^<2+> / EF-hand / 繊毛運動 / 細胞運動 |
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| Research Abstract |
ゾウリムシの繊毛の波打ち運動の方向は、繊毛膜上の電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化によって制御される。これまで、このチャンネルの必須制御因子としてCa^<2+>結合蛋白質Centrinを同定した。Centrinの機能部位の特定を分子遺伝学的手法で試みた結果、4つのCa^<2+>結合部位(EF-handl〜4)の内EF-hand4とN末の35アミノ酸が重要な役割を果たしていることを明らかにした。
平成18年度は、これらの機能部位がCentrinの立体構造に与える影響を調べるために、野生型Centrinを大腸菌の系を用いて発現・精製した。精製した蛋白質をCentrinの突然変異株cnrCの細胞質内に顕微注入した結果、変異形質が治癒され電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化が見られた。このことは、リコンビナントCentrinが内在性のCentrinと同等の機能を持つことを示している。次に、リコンビナントCentrinをベースとして、N末の35アミノ酸を欠失させたCentrin(N末欠損型)とEF-hand4を含むC末側の28アミノ酸を欠失させたcnrCタイプのCentrin(cnrC型)を調製した。野生型、N未欠損型、cnrC型Centrinをそれぞれ0.1mM EGTA存在下もしくは0.1mM CaCl_2存在下で保温した後、それぞれのサンプルをSDS-PAGEとNative-PAGEで解析した。その結果、SDS-PAGEのパターンに違いは見られなかったが、野生型とcnrC型CentrinはNative-PAGEにおいて、Ca^<2+>存在下で見かけの分子量が大きくなっていた。一方、N末欠損型は、Native-PAGEにおいて、Ca^<2+>の有無での移動度の変化は他の2者に比べて僅かであった。N末欠損型は全てのEF-handが正常でCa^<2+>+の結合性には問題無いと考えられることからも、CentrinのCa^<2+>依存的な立体構造の変化にはN末部分が重要な役割をしていることが示唆された。また、野生型とcnrC型においてはCa^<2+>の存在下の方が見かけの分子量が大きくなっていることから、CentrinはCa^<2+>の依存的に構造が開いたような状況になることが推測された。
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