光解除型RhoおよびRho活性指示薬の,作製と生細胞への応用

Research Project

Project/Area Number	17770135
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biophysics
Research Institution	The Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	宮内崇行 The Institute of Physical and Chemical Research, 細胞機能探索技術開発チーム, リサーチアソシエイト (00392142)
Project Period (FY)	2005 – 2007
Project Status	Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help	¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000) Fiscal Year 2007: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000) Fiscal Year 2006: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2005: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	small GTPase / Rho / Rac / Cdc42 / 蛍光蛋白質 / 細胞質分裂 / 微小管 / イメージング / 細胞内シグナル / Ras / 多量体化
Research Abstract	Rho GTPases(RhoA, Rac, Cdc42, etc.)は,神経細胞の軸索伸展・シナプス形成・再生,そして癌細胞の浸潤・転移等々,細胞骨格の再編成を伴う数多くの細胞現象を制御していることが知られている。最重要課題の1つは,GTPase同士の問に存在するクロストークの記述である。私を含めた一部の研究者は,細胞内の限定された領域においてRho GTPases同士が互いに影響を及ぼし合うことが重要と予測していたが,検証は難しかった。内在性のRho GTPases自身の活性を検出する良い方法が無く,さらに多種の同時観察は不可能であった。本研究は,上記課題を新規活性インディケータの開発によって克服しようと意図し,さらにその活性指示薬を用いてRhoの細胞機能を明らかにしていくことを目的とした。本研究において,高感度な内在性Rho family small GTPasesの活性を可視化するプローブの開発に成功し、さらに、Rho GTPaseそれ自身の細胞内局在を正確に可視化するプローブの開発にも成功した。かつては欠点と思われがちだった蛍光蛋白質の多量体化の性質を逆に利用したのである。この手法は,Rho以外のシグナル蛋白質の動態イメージングにも広く応用可能であることを示した。加えて,一種類のインディケータを観測するために必要な波長領域が比較的狭いために,同時に多種のシグナル蛋白質の動態を観察することが可能になった。開発したRho活性のインディケータを,特に細胞の分裂におけるRhoの活性制御に注目して研究を進めた。細胞質分裂は基本的な生命現象であるにもかかわらず,分裂が時間的空間的に極めて限定された領域でおこる理由は明確ではなかった。ここに,内在性Rhoのと,その活性制御に関与する蛋白質の高感度なイメージングを行うことで,微小管の構造と分裂溝の形態の関係を明らかにすることが出来た。