誘導型高発現遺伝子プロモーターの調節機構の解明および機能開発

Research Project

Project/Area Number	17780074
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Applied biochemistry
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	橋本義輝筑波大学, 大学院生命環境科学研究科, 講師 (00323254)
Project Period (FY)	2005 – 2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000) Fiscal Year 2006: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 2005: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	シュードモナス / ニトリル / 代謝 / 発現 / クローニング / 塩基配列 / 細菌
Research Abstract	ニトリル分解菌Pseudomonas chlororaphis B23(以下、B23株と略)は、Nitrile hydratase (NHase)により様々なニトリルをアミドに変換し、生じたアミドをさらにAmidaseにより酸とアンモニアに分解する。両酵素は、ニトリルを合成する酵素Aldoxime dehydrataseなどのニトリル代謝関連酵素群とともに遺伝子クラスターを構成している。本遺伝子クラスターのプロモーターは発見できていない為、本クラスターはさらに上流まで伸びていると考えられた。前年度、上流のクローン化に成功し、取得した断片中からプロモーター領域を発見した。プロモーターのすぐ下流にレポーター遺伝子を導入し、レポーター酵素活性を測定することでプロモーター活性の検討を試みた。まず、数種の抗生物質を用いてB23株の薬剤耐性を調べ、感受性を示す抗生物質を探索した。次に、B23株が感受性を示す抗生物質耐性遺伝子を持ついくつかのプラスミドをB23株に導入し、B23株で複製可能なプラスミドを探索した。このプラスミドを用いて、レポーター遺伝子のすぐ上流にプロモーターと予想される断片を連結しB23株に導入した。しかし、B23株内に導入したものの、プラスミドは安定に保持されずプラスミドの欠失がおこり、レポーター酵素活性を測定することできなかった。前年度発見できた上流逆向きに転写調節タンパク質と相同性を示すORFを詳細に解析するために、本タンパク質の発現プラスミドを構築した。大腸菌を宿主として導入したところ、発現は確認できるものの全て不溶性穎粒となり、可溶性に発現する条件検討を行った。しかし、いずれの条件においても本タンパク質を可溶性に発現させることに成功しなかった。