特異な反応・基質認識機構を有する糖質関連酵素の構造機能研究

• Project/Area Number: 17780079
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 助手 (00302589)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2006: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2005: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
• Keywords: 糖質関連酵素 / 結晶構造解析 / ホスホリラーゼ / 糖質結合ドメイン / バイオマス分解

Research Abstract

GH54アラビノフラノシダーゼのアラビノース結合ドメイン(CBM42)の結合サイトの構造・機能解析を行った。今年度は、不溶性基質に対する動力学解析を行った結果、結合サイトの破壊変異体では著しく反応速度が低下することが明らかになった。また、各種の糖質との阻害実験、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー測定、アラビノオリゴ糖との複合体の結晶構造解析から、CBM42が基質アラビノキシランのアラビノフラノース側鎖に特異的に結合することが明らかになった(Biochem.J.誌に掲載)。
GH94セロビオースボスホリラーゼでは、昨年度までに決定した2種類の複合体構造(Biochem.J.誌に掲載)を基に分子モデリングを行い、活性中心付近の残基を置換した変異体を約30種類作成した。その中から、ラクトース分解活性が約2倍に向上した変異体が得られた。反応産物にガラクトース1リン酸を確認したことから、この変異体はサブサイト-1にガラクトースを結合できる能力が高いと考えられる(論文執筆中)。
その他の、特異な基質認識機構を有する酵素として、白色腐朽菌由来β-グルコシダーゼの結晶構造を決定した。白色腐朽菌は木材を分解する酵素を多数分泌する菌として有名であるが、本酵素は菌体内に存在し、バイオマス分解産物の資化およびその他の配糖体の分解に関わると考えられている。本酵素の結晶構造から、サブサイト+1が既知のβ-グルコシダーゼと全く異なることが明らかになり、特異な基質認識機構が解明された(FEBS.Lett.誌に掲載)。
なお、本課題はこれで最終年度になるため、本課題の成果を中心にまとめた総説を発表予定である(J.Appl.Glycosci.誌で印刷中。2007年度54巻2号に掲載予定)。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of intracellular family 1 β -glucosidase BGL1A from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium (2007)
  • Author(s): Y.Nijikken et al.
  • Journal Title: FEBS Lett. 581・7 Pages: 1514-1520
• [Journal Article] Strucatural dissection of the reaction mechanism of cellobiose phosphorylase (2006)
  • Author(s): M.Hidaka et al.
  • Journal Title: Biochem.J. 398・1 Pages: 37-43
• [Journal Article] The family 42 carbohydrate-binding module of family 54 α -L-arabinofuranosidase specifically binds the arabinofuranose side chain of hemicellulose (2006)
  • Author(s): A.Miyanaga et al.
  • Journal Title: Biochem.J. 399・3 Pages: 503-511
• [Journal Article] Crystal structure of GH54 α -L-arabinofuranosidase and unique function of CBM42 attached to it (2006)
  • Author(s): Miyanaga et al.
  • Journal Title: J.Appl.Glycosci. 53・2 Pages: 143-148
• [Journal Article] Mutational analysis of N-glycosylation recognition sites on the biochemical properties of Aspergillus kawachii α -L-arabinofuranosidase 54 (2006)
  • Author(s): Koseki et al.
  • Journal Title: Biochim.Biophys.Acta 1760・9 Pages: 1458-1464
• [Journal Article] N-Linked oligosaccharides of Aspergillus awamori feruloyl esterase are important for thermostability and catalysis (2006)
  • Author(s): Koseki et al.
  • Journal Title: Biosci.Biotechnol.Biochem. 70・10 Pages: 2476-2480
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of cytosolic α-mannosidase from Thermotoga maritima (2006)
  • Author(s): M.Nakajima et al.
  • Journal Title: Acta Cryst. Section F 62・2 Pages: 104-105
• [Journal Article] Structural basis for the specificity of the reducing end xylose-releasing exo-oligoxylanase from Bacillus halodurans C-125 (2005)
  • Author(s): S.Fushinobu et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280・17 Pages: 17180-17186
• [Journal Article] Reaction mechanism and substrate recognition of GH-94 phosphorolytic enzymes (2005)
  • Author(s): M.Hidaka et al.
  • Journal Title: J.Appl.Glycosci. 52・2 Pages: 191-196
• [Journal Article] Role of the conserved arginine residue in the loop 4 of glycoside hydrolase family 10 xylanases (2005)
  • Author(s): M.Nishimoto et al.
  • Journal Title: Biosci.Biotechnol.Biochem. 69・5 Pages: 904-910
• [Journal Article] Mutational analysis of a feruloyl esterase from Aspergillus awamori involved in substrate discrimination and pH dependence (2005)
  • Author(s): Koseki et al.
  • Journal Title: Biochim.Biophys.Acta 1722・2 Pages: 200-208
• [Journal Article] Biochemical characterization of recombinant acetyl xylan esterase from Aspergillus awamori expressed in Pichia pastoris : Mutational analysis of catalytic residues (2005)
  • Author(s): Koseki et al.
  • Journal Title: Biochim.Biophys.Acta 1749・1 Pages: 7-13