不均一流下における土壌微生物の群集構造が窒素循環に及ぼす影響

• Project/Area Number: 17780188
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Irrigation, drainage and rural engineering/Rural planning
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 末継 淳 Tottori University, 乾燥地研究センター, プロジェクト研究員 (50398335)
• Project Period (FY): 2005 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2007: ¥300,000 (Direct Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2006: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2005: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: 土壌圏現象 / 窒素徳環 / 微生物 / 分子生態 / 砂漠化 / 窒素循環

Research Abstract

不均一流下での土壌微生物の群集構造とその窒素循環へ影響を明らかにするために、滅菌型ヘレ・ショウ土壌槽を用いた培養実験を行い、不均一流内外の土壌DNAを抽出してPCR後、変性剤勾配ゲル電気泳動法(DGGE)でDNAを分離し、分離バンド数と蛍光強度からShannon-Wienerの多様性指数を求めた。しかし、DGGE法を多様性評価に用いるには、メタゲノム試料のheteroduplexが問題となるため、ssDNAとheteroduplexを分解・断片化するS1ヌクレアーゼ処理を行い、多様性指数を修正した。この問題はrDNAなどの進化的に保存された配列で深刻で、S1ヌクレアーゼ処理のないPCR-DGGE法では、最大で微生物種数の2乗の増幅産物が与えられることを示した。また、TaqDNAポリメラーゼは増幅エラーによって多様性指数に影響を与え、非特異産物と培養不能な微生物のDNAが区別できなくなるため、φ29DNAポリメラーゼを用いた予備増幅後、3'末端を固定化核酸で修飾したプライマーと3'->5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを併用したPCRで、DGGE法の効率を高める工夫を行った。DNAに基づく土壌微生物の解析では、死滅微生物のDNAが混入する可能性があるため、分解の速いRNAに基づく解析も試みた。しかし、コンポスト中のRNA回収率はDNA回収率と比べて著しく低く、コンポスト化時の加熱で死滅した微生物や、放線菌などの内生胞子のDNAが多量に含まれることが塩基配列からも確認された。また、CARD-FISH法による微細スケールでの微生物空間分布解析は、土壌の自家蛍光等の問題のため、今後の課題となった。根粒菌の単一菌株を対象としたRNAの検出は可能であったため、窒素循環と空間分布形成に関与する遺伝子の解析を行った。以上の結果を国際誌に投稿するため2報の論文にまとめた。

Research Products

• [Journal Article] Spatial distribution of nitrogen-fixing/denitrificating microorganisms in soils with preferential flow (2006)
  • Author(s): Atsushi Suetsugu
  • Journal Title: Abstracts of World Congress of Soil Science 18 Pages: 366-367
• [Journal Article] 不均一流下における窒素固定菌類の多様度の空間変動 (2006)
  • Author(s): 末継 淳
  • Journal Title: 日本土壌肥料学会講演要旨集 52 Pages: 12-12
• [Journal Article] 不均一流下における土壌中の窒素固定菌類および脱窒菌類の空間分布 (2006)
  • Author(s): 末継 淳
  • Journal Title: 乾燥地研究センター共同研究発表会講演要旨集 Pages: 98-101
• [Journal Article] Spatial distribution of nitrogen-fixing and denitrificating microorganisms in soils with preferential flow (2006)
  • Author(s): Atsushi Suetsugu
  • Journal Title: Proceedings of World Congress of Soil Science 18(accepted)
• [Journal Article] PCR-DGGE法による耐乾性窒素固定菌類の探索 (2005)
  • Author(s): 末継 淳
  • Journal Title: 土壌物理学会講演要旨集 47 Pages: 81-82
• [Journal Article] 携帯型誘電率水分計による土壌中の二次元水分分布の非破壊測定 (2005)
  • Author(s): 末継 淳
  • Journal Title: 乾燥地研究センター共同研究発表会講演要旨集 Pages: 85-86
• [Presentation] 機能遺伝子アレイ法によるダイズ根粒菌の高塩濃度ストレスに対する遺伝的応答解析 (2007)
  • Author(s): 末継 淳
  • Organizer: 鳥取大学乾燥地研究センター共同研究発表会
  • Place of Presentation: 鳥取大学乾燥地研究センター
  • Year and Date: 2007-12-04
• [Presentation] 機能遺伝子アレイ法による耐塩性微生物群集の遺伝子発現解析 (2007)
  • Author(s): 末継 淳
  • Organizer: 日本土壌肥料学会
  • Place of Presentation: 東京農業大学世田谷キャンパス
  • Year and Date: 2007-08-23