酵母ゲノムワイド解析で得た異種タンパク質分泌生産抑制遺伝子の機能解析

• Project/Area Number: 17780253
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied molecular and cellular biology
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 星田 尚司 山口大, 工学部, 助手 (00314823)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000); Fiscal Year 2006: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2005: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: 酵母 / 異種タンパク質 / 分泌生産 / ゲノムワイド解析

Research Abstract

酵母遺伝子破壊株セットを用いたハイスループットスクリーニングにより得た異種ラッカーゼタンパク質を高発現できる20の遺伝子破壊株の破壊遺伝子の機能を明らかにする目的で以下の実験を行った。
麹菌由来グルコアミラーゼ遺伝子を恒常的高発現TDH3プロモータ下流に挿入し、20の破壊株でのグルコアミラーゼ発現量を調べた。実験に使用した酵母株はマルトースを炭素源として増殖することができないが、グルコアミラーゼを分泌生産することでマルトース培地でも、ゆっくりではあるが生育することが可能になる。スクリーニングで得た20株中14株で親株に比べて明らかに増殖速度が増加した。これはグルコアミラーゼ分泌生産量が増加したためであると考えられ、ラッカーゼ以外の異種タンパク質の発現にも効果があることがわかった。
次に、20の遺伝子がラッカーゼ分泌生産過程のどこに関与しているかを明らかにする事を目的とし、まず転写レベルの解析をリアルタイムPCRにより行った。その結果、7つの破壊株での転写産物量が親株に比べ2〜8倍大きいことがわかった。さらに、酵母のネイティブ分泌タンパク質である酸性フォスファターゼをレポータータンパク質として用い、転写レベルでの発現量の強さを調べた。ラッカーゼと同様にCUP1プロモーターで発現を制御し、組換え体として発現させた。その結果、転写レベルが大きかった7株のうち6株で活性が増加した。ネイティブタンパク質である酸性フォスファターゼは酵母内で容易に構造形成でき、その活性値が転写産物量を示すと考えられる。従って、少なくとも6つの遺伝子は転写レベルで働いていることが明らかになり、他の14遺伝子が転写以降の過程で働いていることを示唆している。
次年度は、これら14の遺伝子の機能を詳細に調べ、それらの結果をもとに異種タンパク質を高発現できる宿主の育種を行う。