走査プローブ顕微鏡による細胞膜受容体・リガンド相互作用の生体ナノ計測

• Project/Area Number: 17780257
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied molecular and cellular biology
• Research Institution: Prefectural University of Hiroshima
• Principal Investigator: 吉野 智之 県立広島大学, 生命環境学部, 講師 (30391204)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2006: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2005: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: 走査プローブ顕微鏡 / 可視化 / 計測工学 / ナノバイオ / 1分子計測(SMD)

Research Abstract

生きている細胞の観察のための走査プローブ顕微鏡(SPM)の制御法は一般化できておらず、経験が必要な技術である。
CHO-K1細胞に、蛍光蛋白質を結合させたスカベンジャー受容体(CFP-LOX-1)を遺伝子導入した低発現株(T株)を対象試料とし、SPMによりLOX-1の分布状態を可視化した。また、リガンドである変性低密度蛋白質のひとつであるアセチル化LDL(DiI-AcLDL)を反応させたCHO:T細胞の表面形状も観察した。実験には、倒立型光学顕微鏡一体型SPMを用い、蛍光顕微鏡で蛍光状態を確認した後、PBS中、共振モードで行った。まず、SPMを用いて生きている細胞膜上に存在しているCFP-LOX-1の分布状態を可視化した。光学顕微鏡で蛍光状態を確認しながら、バネ定数が低い探針(約0.09N/m)を使用し走査速度を低く設定すること(30分/1フレーム)で、高分解能で表面形状を観察することができた。その結果、細胞表層のCFP-LOX-1の周囲が窪んでいるような形状が観察された。次に、CHO:T細胞にリガンドを添加すると約5分で細胞が収縮してしまうため、4%パラホルムアルデヒド/PBS溶液を用いて、細胞を固定せざるを得なかった。しかしながら、その観察から、CFP-LOX-1は細胞表層全体に分布していたが、DiI-AcLDLには偏りがあることがわかった。水平分解能は約10nmであった。さらに、AcLDLを結合させた修飾プローブを作製し、細胞表層のLOX-1との相互作用を計測し、ナノレベルの動的解析を行った。修飾SPMプローブをCHO:T細胞にアプローチをさせたところ、若干の収縮が見られ、ある程度の機能性を保持したままSPMプローブにDiI-AcLDLを結合させることに成功したことがわかった。この修飾プローブにより、細胞上の吸着力の差の可視化が可能になった。