Research Project
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
本研究では、細胞内に存在する硫酸化糖脂質に焦点を当て、その機能を解明する事を目的としている。17年度の研究では、ヒト腎臓癌細胞株SMKT-R3の細胞質画分に硫酸化糖脂質と複合体を作ると思われるタンパク質が存在することを見いだした。18年度はこの硫酸化糖脂質と複合体を作ると思われるタンパク質の精製を行い、MALDI-TOF-MSを用いたペプチドマスフィンガープリント法などにより同定を試みた。前年度の実験ではウエスタンプロットにより約100KDaのタンパク質を見いだしたが、まずこのタンパク質が抗硫酸化糖脂質抗体D18により免疫沈降ができるか否かを検討した。D18をProteinG-sepharoseに結合させSMKT-R3の細胞質画分と混合し通常の免疫沈降実験を行った。その結果、ウェスタンブロツトの結果と同様に約100KDaの場所に沈降タンパク質が観察された。この結果から、目的タンパク質は免疫沈降により精製できる可能性が示唆された。次にSMKT-R3細胞約2x10^7個から細胞質画分を調製し上記免疫沈降法をおこなって、銀染色で解析したところ上記約100KDaのタンパク質と考えられるバンドおよびそれ以外に40KDa付近などにいくつか有意に免疫沈降されてくるタンパク質バンドを見いだした。さらに、これらのタンパク質をできるだけ多く精製するためにSMKT-R3細胞の大スケール培養を行って、それら細胞質画分を用いて上記免疫沈降法により精製を試みた。得られた精製試料をSDS-PAGEで解析しMS分析用銀染色により染色すると、4種類の有意なバンドが検出された。これらについて大阪府立母子保健総合医療センター研究所代謝部門の協力によりMALDI-TOF-MSを用いたペプチドマスフィンガープリント法を行い、各タンパク質の同定を試みた。その結果、40kDa付近のバンド1つについて有意な解析結果を得る事ができ、このバンドがDNA結合タンパク質の一種であるY box-binding protein (YB1)であることが示唆された。
