核酸標識抗体作製技術に基づく迅速・超高感度抗原検出法に関する研究

• Project/Area Number: 17790301
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 花木 賢一 東京大学, 大学院医学系研究科, 助手 (40376421)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2006: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2005: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: PCR / ELISA / 核酸標識抗体 / B型肝炎ウイルス

Research Abstract

イムノPCR法を安価、迅速、簡便、超高感度、かつ多検体処理可能な抗原検出法にするために検討を行って、以下のことを確立した。
1.レポーターDNA(rDNA)は76塩基の合成DNAとし、rDNAを抗原認識抗体に直接化学標識した。
2.PCRは最短時間で十分な増幅を実現するために、40分(35サイクル)で完了する条件を決定した。
3.PCR産物の検出は、2通りのPCR-ELISA:ビオチン標識プライマーとジゴキシゲニン(dig)標識プライマーまたはdig標識ヌクレオチドによるPUR法を碓立した。PCR-ELISAはストレプトアビジン固相マイクロプレートを用いて常法により行った結果、dig標識ヌクレオチドを用いたPCR法がdig標識プライマーを用いたPCR法よりも検出限界は100倍優れていた。
イムノPCR法はB型肝炎ウイルスS抗原(HBsAg)を常法によりPCRチューブへ固相化して検討した。そして、既存法であるELISAプレートによるHBsAgの関節抗体法の検出限界が210pg/mLであったのに対し、dig標識プライマーを用いたイムノPCR法のそれは500fg/mLであった。(420倍の検出限界向上)。また、全工程にかかる時間は約3時間であったことから、概ね所期の目標を達成することができた。dig標識ヌクレオチドを用いたイムノPCR法の検出限界は更に向上すると期待される反面、ランニングコストが大きい欠点がある。そのため、コストを考慮した反応組成の最適化を検討している。