肝胆道系癌細胞に特異的なmicroRNAの同定と発現プロファイル解析

Research Project

Project/Area Number	17790931
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Digestive surgery
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	三嶋拓也日本医科大学, 大学院医学系研究科, ポストドクター (00398877)
Project Period (FY)	2005 – 2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000) Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2005: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Keywords	癌 / 胆管系悪性腫瘍 / 核酸 / ゲノム / microRNA / 外科 / microRNA cloning / microRNA real time PCR / microRNA microarray / 胆管細胞癌
Research Abstract	研究計画に基づき、胆管系悪性腫瘍由来の培養細胞株である「HuCCT1」「MEC」ならびに正常ヒト胆管上皮培養細胞株「HiBEpic」の計3細胞株よりmicroRNA (miRNA)クローニングを行い、各々より10,000個を超えるmiRNAクローンを取得した。得られたmiRNAクローンは、miRBASEデータベースを始めとした各種核酸データベースでのBLAST検索を行い、各々の細胞株でのmiRNA発現プロファイルを解析した。解析の結果、癌細胞、正常細胞に特異的と判断される約10種類のmiRNAが確認された。クローニング解析の結果から得られた癌・正常培養細胞における発現差を検証するために上記10種類のmiRNAに対し、real-time PCRでの検証を行い、全てにおいて同様な発現差が検証された。さらに得られた計36,000個のsmall RNAクローン中には、miRNAを含む、各種RNAデータベースと一致する配列でなく、genome DNA中には相同配列を持ち、2次構造予測上、miRNAの条件を満たすクローン、つまり新規miRNAが最低10種類は含まれていることが確認された。これらの結果は、投稿準備中である。また今回の研究の中で、2度のPCRを行うことでmiRNAのクローニング効率を高めることが出来る独自のmiRNAクローニング手法を開発した。得られたsmall RNAクローン中に占めるmiRNAの比率は60〜80%と非常に高率である。我々独自のクローニング手法はBio View (2006)に発表された。また、新規miRNAのreal-time PCRでの発現確認を行うための予備実験として、独自に開発したプライマー、プローブデザイン手法をBrain Res (2006)に発表し、多くの成果を収めることができた。