機械的刺激による骨芽細胞におけるCTGFの転写調節メカニズムについて

Research Project

Project/Area Number	17791523
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Orthodontic/Pediatric dentistry
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	川邉紀章岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (00397879)
Project Period (FY)	2005 – 2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000) Fiscal Year 2006: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2005: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
Keywords	CTGF / 骨芽細胞 / 機械的刺激
Research Abstract	マウスCTGFプロモーターをクローニングするために、鋳型としてマウス骨髄細胞より調製されたゲノムDNAライブラリーを作製した。Abrahamら(J.Boil.Chem.,2000)により発表されたマウスCTGFプロモーター領域にはTGF-β・TNF-αといった、骨芽細胞の分化に影響を及ぼすサイトカインに応答する領域が存在することが報告されている。従って、この報告と同じプロモーター領域(-805から+17)をクローニングするためにプライマーを設計し、PCRにてクローニングを行った。PCRにより得られたCTGFプロモーター断片は、TAクローニングベクターへ組み込み、DNAシークエンサーにて塩基配列の確認を行った後に、改めてpGL3 Basic Vectorへ組み込んだ(pmCTGF-pGL3)。得られたpmCTGF-pGL3はマウス骨芽細胞様細胞株であるMC3T3-E2細胞にLipofectAMINE法にて遺伝子導入を行い、フローサイトメトリーにて単一細胞コロニーを分離し、pmCTGF-pGL3の組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子陽性細胞株の樹立を行った。また、制限酵素を用いてこのCTGFプロモーターから欠損型プロモーターを作成し、上記の方法と同様にpGL3 Basic Vectorへ組み込み、MC3T3-E2へ遺伝子導入を行い、細胞株樹立を行った。これらの細胞株を複数用いて、機械的刺激におけるCTGFプロモーターの活性化についての検討を、刺激時間等の条件を変化させながら行った。今後は、さらにこの欠損型プロモーターを詳しく解析し、機械的刺激によるCTGFプロモーターのエンハンサーおよびサブレッサー領域の同手、およびプロモーターの制御メカニズムについて解析していく予定である。