| Project/Area Number |
17H01580
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Research Field |
Digestive surgery
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北畑 裕司 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (00535338)
川井 学 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (40398459)
岡田 健一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50407988)
勝田 将裕 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (50464673)
尾島 敏康 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60448785)
廣野 誠子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60468288)
宮澤 基樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90549734)
清水 敦史 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (00637910)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥42,900,000 (Direct Cost: ¥33,000,000、Indirect Cost: ¥9,900,000)
Fiscal Year 2020: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2019: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Fiscal Year 2018: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000)
Fiscal Year 2017: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000)
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| Keywords | iPS細胞 / 樹状細胞 / がんワクチン / 膵癌 / カクテルペプチド / 癌ワクチン / ペプチド / 臨床試験 / 膵癌ワクチン / 膵癌免疫療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度は昨年度に引き続きエピソーマル・プラスミド法で誘導したiPS-DCの抗腫瘍効果の解析を行った．KIF20A, MUC16, Mesothe lin, VEGFR1, R2発現プラスミドベクターを作成し，各蛋白の発現をFACSおよびウエスタンブロッティングで確認した．このベクターを健常人由来iPS-DCにエレクトロポレーション法で導入し，2日間培養した．刺激後のDCの表面マーカーCD80, CD83 , CD86, MHC-classI，classIIおよびCCR7, TLR2,4を確認したところ，刺激前と比較し，CD80 (75%が88%), CD86 (86%が98%), CCR7 (45%が62%)の発現増強をFACSにて確認した．続いて，刺激後iPS-DCをstimulatorとし，PBMCとin vitro刺激を3回行い，bulk CTLを誘導し，その後MACSにてCD8 CTLを誘導した．現在，メソテリン遺伝子導入LCLを疑似ターゲットとした細胞傷害活性をCrリリース法にて確認している．
また令和元年度は前臨床試験（iPS-DCの品質管理） を開始した．具体的には，細胞表面マーカーの解析；3x105個のカクテルペプチド刺激iPS-DCをflow cytometryを用いてisotype (1k, 2ak)およびCD86,HLA-DRを解析した。無菌試験；日本薬局方無菌試験法に従い、メンブレンフィルター法で液体チオグリコール酸培地・ソイビ ーン・カゼインダイジェスト培地を使用して、14日間培養して無菌性を担保した．現在，エンドトキシン測定およびマイコプラズマ否定試験を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
KIF20A, MUC16, Mesothe lin, VEGFR1, R2発現プラスミドベクターの作製に難渋した．各遺伝子の連結がうまくいかず，VEGFR1 R2遺伝子の導入が困難であった．試行錯誤のうえ，コザック配列をVEGFR1 R2遺伝子の上流に挿入することで、スムーズな蛋白発現が可能となった．その後のin vitro CTLの誘導は問題なく行えている．また令和元年度はiPS-DCの前臨床試験を開始した．本研究の臨床応用実現に向け，着実に研究は進んでいる．以上よりおおむね順調に進展しているとした．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は引き続き，カクテルペプチド刺激iPS-DCのメソテリン特異的な細胞傷害活性の測定を行う．健常人ドナー5名のiPS-DCがすでに誘導されており，またおのおののLCLの樹立も終了している．まずは，ドナーLCLにメソテリン遺伝子を導入した疑似の陽性ターゲット，またコントロールベクターにて作成したネガティブターゲットを利用し，in vitro CTLが，メソテリン特異的な細胞傷害活性を有することを確認する．その後，VEGFR1 R2遺伝子導入に伴う，腫瘍新生血管をターゲットとしたCTL assayを行う．必要に応じ，CTLクローンを誘導する予定である．LCLをターゲットとした研究が終了したら，腫瘍細胞株を用いた研究を行う．HLA A24陽性のドナー3名よりin vitro CTLを誘導し，同様にHLA A24陽性かつメソテリンを発現しているMIAPACA2, Pan01をターゲットとした細胞傷害活性誘導を試みる．
iPS-DCの前臨床試験に関しては，無菌試験；日本薬局方無菌試験法に従い、メンブレンフィルター法で液体チオグリコール酸培地・ソイビ ーン・カゼインダイジェスト培地を使用して、14日間培養して無菌性を担保する．エンドトキシン測定；日本薬局方エンドトキシン試験に従 い、検量線の信頼性確認試験を行う．エンドトキシンによる試薬の活性化に伴って形成されるゲルによる吸光度を測定する． マイコプラズマ否定試験；日本薬局方マイコプラズマ否定試験に従ってPCRで解析する．一般毒性試験（間歇投与試験）；用量段階は1用量 とし、げっ歯類1種のヌードマウスを20例で検討する。iPS-DC投与数は1x106個/kgで、皮内に3回間歇的に投与する．
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