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生理活性化合物の新規標的タンパク質同定法の開発と植物シグナル伝達物質受容体の解明

Research Project

Project/Area Number 17J03994
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Biomolecular chemistry
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

穴吹 友亮  北海道大学, 農学院, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2017-04-26 – 2020-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2019: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2018: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2017: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords標的タンパク質 / 蛍光基 / アフィニティークロマトグラフィー / 光親和性標識法 / クリック反応
Outline of Annual Research Achievements

生理活性化合物の標的タンパク質同定のためには、標的タンパク質を精製し、アミノ酸配列解析に供することが重要である。ビオチンなどの検出基で修飾した生理活性化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる標的タンパク質の精製は多くの研究例がある。しかし、本方法では非特異的に吸着されたタンパク質の混入や回収率の低さという問題があり、標的タンパク質のアミノ酸配列解析を妨げる要因となっている。そのため、この問題を解決した手法を開発できれば、正確でより簡便な標的タンパク質同定が可能になる。そこで、本研究では純度が低いサンプルにおいても標的タンパク質の正確なアミノ酸配列解析を可能にするという観点から、蛍光基を利用した新規な標的タンパク質同定法の開発を研究テーマとした。本手法では、生理活性化合物の化学修飾を最小限に止めたアジドプローブおよびリンカーを用いて蛍光基を標的タンパク質に導入する。当該年度は、これまでに合成した蛍光基を有するリンカーを用いて、新規手法の有効性の検証実験を行った。有効性の検証においては、アブシジン酸(ABA)とその受容体AtPYL2の既知の相互作用を対象とした。組換えAtPYL2を過剰発現した大腸菌由来の粗タンパク質抽出液とABA由来のアジドプローブをインキュベートした。次に、蛍光基を有するリンカーとヨウ化銅を添加し、クリック反応によりアジドプローブに結合させた。360 nmのUVを照射し、標的タンパク質とリンカーのクロスリンクを行った。蛍光基がAtPYL2に導入していることを確認するため、反応後の粗タンパク質抽出液を電気泳動に供した後、ゲル撮影装置を用いて蛍光の検出を試みた。しかし、組換えAtPYL2の分子量付近に蛍光は検出されなかった。本年度内にその原因を特定することはできなかったため、今後手法が有効になるように改良していく必要がある。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(3 results)
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report
  • 2017 Annual Research Report
  • Research Products

    (7 results)

All 2019 2018

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] Identification of recombinant AtPYL2, an abscisic acid receptor, in E. coli using a substrate-derived bioactive small molecule, a biotin linker with alkyne and amino groups, and a protein cross-linker2019

    • Author(s)
      Anabuki Tomoaki、Ito Yusuke、Ohashi Keisuke、Takasuka Taichi E.、Matsuura Hideyuki、Takahashi Kosaku
    • Journal Title

      Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters

      Volume: 29 Issue: 21 Pages: 126634-126634

    • DOI

      10.1016/j.bmcl.2019.126634

    • Related Report
      2019 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Novel biotin linker with alkyne and amino groups for chemical labelling of a target protein of a bioactive small molecule2018

    • Author(s)
      omoaki Anabuki, Miu Tsukahara, Masanori Okamoto, Hideyuki Matsuura, Kosaku Takahashi
    • Journal Title

      Bioorganic & medicinal chemistry letters

      Volume: 28 Issue: 4 Pages: 783-786

    • DOI

      10.1016/j.bmcl.2017.12.055

    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 新たなアブシジン酸結合タンパク質の同定2019

    • Author(s)
      穴吹友亮, 大橋慧介, 高須賀太一, 松浦英幸, 高橋公咲
    • Organizer
      植物化学調節学会第54回大会
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Presentation] 新規なリンカーとタンパク質架橋剤を用いる生理活性化合物の標的タンパク質精製法2019

    • Author(s)
      穴吹友亮、伊藤祐輔、塚原美宙、高須賀太一、岡本昌憲、松浦英幸、高橋公咲
    • Organizer
      日本農芸化学会 2019年度大会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] 新規なリンカーとタンパク質架橋剤を用いる生理活性化合物の標的タンパク質解析2018

    • Author(s)
      穴吹友亮、伊藤祐輔、塚原美宙、高須賀太一、岡本昌憲、松浦英幸、高橋公咲
    • Organizer
      第60回天然有機化合物討論会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Book] アグリバイオ 2019年4月号2019

    • Author(s)
      穴吹 友亮, 高橋 公咲
    • Total Pages
      102
    • Publisher
      北隆館
    • Related Report
      2019 Annual Research Report
  • [Book] 化学と生物2018

    • Author(s)
      穴吹友亮、高橋公咲
    • Total Pages
      2
    • Publisher
      株式会社 国際文献社
    • Related Report
      2018 Annual Research Report

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Published: 2017-05-25   Modified: 2024-03-26  

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