Structural and functional analysis of bacterial type IV secretion system

• Project/Area Number: 17J40044
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bacteriology (including mycology)
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 安藤(北尾) 公英 岐阜大学, 医学系研究科, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 細菌感染 / 分泌装置 / レジオネラ / IV型分泌装置 / 病原細菌

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではレジオネラの感染に必須のDot/Icm IV型分泌装置の3つのATPaseの役割に着目し研究を実施した。これまでに、内膜に局在するDot/Icmタンパク質DotIとDotJが安定なヘテロ内膜複合体を形成すること、また、このヘテロ内膜複合体と3つのATPaseのうちの1つとの間に遺伝学的相互作用が見られることがわかっている。そこで、本研究ではこのヘテロ内膜複合体とATPaseの構造解析に向けて、これらの生化学的な相互作用について解析した。具体的には、StrepタグとFLAGタグを用いてヘテロ内膜複合体とATPaseの3者を同時発現可能な系を構築し、大腸菌内で発現誘導後に、3者複合体が内膜で形成されるかどうかを調べた。まず、発現誘導後に菌を破壊し、界面活性剤を用いて膜画分を抽出、そして、ゲル濾過カラムを用いて3者複合体を含む可能性のある画分を得た。続いて、この画分をブルーネイティブPAGEと抗ATPase抗体を用いたウェスタンブロットにより解析した結果、3者複合体は、約700kDaの複合体の画分に含まれていることが明らかになり、ヘテロ内膜複合体とATPaseが直接的に相互作用している可能性を示唆していた。同時に、同様の系で精製したヘテロ内膜複合体のみを用いて、電子顕微鏡下で構造を観察した。しかし、タンパク質複合体を確認できたものの、複合体濃度の調整と、支持膜の条件検討が必要であることがわかった。今後は、ヘテロ内膜複合体とATPaseの3者複合体の構造解析を引き続き進めていく予定である。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structural and Functional Analyses of the <i>Legionella</i> Virulence Secretion System (2019)
  • Author(s): Tomoko kubori, Tomoe Kitao, Hiroki Ando
  • Journal Title: Seibutsu Butsuri Volume: 59 Issue: 1 Pages: 014-017
  • DOI: 10.2142/biophys.59.014
  • NAID: 130007557814
  • ISSN: 0582-4052, 1347-4219
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Emerging insights into bacterial deubiquitinases (2019)
  • Author(s): Tomoko kubori, Tomoe Kitao, Hiroki Ando
  • Journal Title: Current Opinion in Microbiology Volume: 47 Pages: 14-19
  • DOI: 10.1016/j.mib.2018.10.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] LotA, a Legionella deubiquitinase, has dual catalytic activity and contributes to intracellular growth. (2018)
  • Author(s): Kubori T, Kitao T, Ando H and Nagai H.
  • Journal Title: Cell Microbiol. Volume: Mar 15 Issue: 7 Pages: e12840-e12840
  • DOI: 10.1111/cmi.12840
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 細菌の病原性制御システム (2020)
  • Author(s): 北尾 公英
  • Organizer: 第93回日本細菌学会総会 シンポジウム「Beyond antibiotics―感染症制御に向けた生物学」
  • Invited
• [Remarks]
  • URL: https://sites.google.com/view/nagai-lab/home
• [Remarks]
  • URL: https://sites.google.com/view/nagai-lab/home
• [Remarks]
  • URL: http://nagailab.biken.osaka-u.ac.jp/