RNF168によるDNA２本鎖切断応答・修復制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K00550
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Research Field	Risk sciences of radiation and chemicals
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	平出祥啓大阪大学, 医学系研究科, 特任研究員 (80795526)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中田慎一郎大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2019-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2019: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2018: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2017: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords	ユビキチン鎖結合ドメイン / Ｋ63結合型ユビキチン鎖 / ユビキチンシグナリング / 放射線生物学 / 逆遺伝学 / DNA2本鎖切断 / ユビキチン鎖 / ユビキチン転移酵素 / ＤＮＡ切断応答 / ＤＮＡ修復制御
Outline of Annual Research Achievements	放射線感受性を呈するヒト免疫不全症候群（RIDDLE症候群）の原因遺伝子として知られるRNF168は、ヒト細胞においてDNA２本鎖切断部位に集積し、その後のDNA切断応答やDNA修復機構の活性化に必須のユビキチン転移酵素である。これまでに、RNF168のDNA２本鎖切断部位への集積は、RNF168に内在する２つのユビキチン鎖結合ドメイン（UDM1、UDM2）が、DNA切断部位近傍に形成されるユビキチン鎖に結合する事で生じることが知られていたが、これらドメインの細胞機能の詳細には不明な点が多かった。本研究では、UDM1、UDM2とＫ63結合型ユビキチン鎖との複合体の結晶構造解析の結果に基づいたRNF168の機能解析を、ヒト骨肉腫培養細胞株を用いて実施した。細胞内在性のRNF168をsiRNAを用いてノックダウンし、さらにUDM1、UDM2のアミノ酸残基を変異させたRNF168をTet-Onプロモーター制御下で発現させた後、ガンマ線照射によるDNA２本鎖切断誘導後のRNF168とγH2AX（DNA２本鎖切断部位の指標）の核内局在を蛍光免疫染色法により解析したところ、あるUDM2の変異体でRNF168がDNA切断部位に集積しなくなることを見出した。また、DNA切断応答分子ＸとγH2AXとの局在解析を行った結果、あるUDM1の変異体でＸのDNA切断部位への集積が減弱していることを見出した。本研究によりRNF168やDNA切断応答分子のDNA切断部位への集積に関わるUDM1、UDM2の新たな細胞機能を1アミノ酸残基レベルで初めて明らかにできた。今年度は、DNA切断修復制御機構におけるUDM1、UDM2の機能解析を目的として、相同組換え修復頻度を測定可能な細胞を樹立するためのプラスミドベクターを構築した。また、RNF168ノックアウト細胞を用い、DNA切断誘導後の種々の解析を実施した。