| Project/Area Number |
17K05899
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Research Field |
Analytical chemistry
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
柄谷 肇 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 教授 (10169659)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 悦 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 教授 (30159214)
布施 泰朗 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 助教 (90303932)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Project Status |
Discontinued (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2017: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 生物発光 / 発光細菌 / 細菌ルシフェラーぜ / ルシフェラーゼコード遺伝子 / 大腸菌 / シアン化物 / 無機ヒ素化合物 / 生物発光可視化 / ルシフェラーゼ / 環境毒性物質 / 活性酸素種 / 呼吸阻害 / 蛍光タンパク質 / 生細胞可視化 / 蛍光発光 / 環境毒性 / 細胞毒性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
呼吸阻害性の環境毒性物質の生物発光可視化を目的として、これまでに構築した過酸化水素感受性発光関連遺伝子をベースに、特に感度とS/N比の向上、並びに再現性の向上を目指して遺伝子機能の強化を進めた。
遺伝子機能強化に関して、ルシフェラーゼ遺伝子クラスター（luxCDABFEG）よりルシフェラーゼ反応に直接関与しないluxGを削除した。29年度ではペルオキシダーゼコード遺伝子プロモーター（katG’）の部分配列を使用していたが、30年において、katG’の全領域をlux遺伝子（luxCDABFE）との融合に供した。融合遺伝子の作製はIn-Fusion反応を用いて行い、制限酵素処理したプラスミドpETBlue-2に挿入した。宿主大腸菌としてE.coli-BL21(DE3)株を引き続き使用した。
呼吸阻害性の環境毒性物質として、無機ヒ素化合物およびシアン化物を対象とし、特にシアン化物に着目した。予備的な実験結果から、新規に作製した遺伝子で形質転換した大腸菌の液体カルチャーにシアン化物イオンを添加することにより、添加後1時間以内に最大発光が観察されることがわかった。さらに液体カルチャーに１～２％となるようにアルギン酸を溶解することにより、発光強度が約２倍増大することまた発光誘導の再現性が向上することを見出した。他方、対数期の発光大腸菌をアルギン酸ゲルに固定化することにより、最大発光到達時間を約12時間遅延させることが可能となり、結果的に測定法の多様性が高められた。発光強度とシアン化物濃度の間には正の相関性が成立し、ゾルの系では低濃度シアン化物の可視化を実現し、検出下限は0.01 mg/Lであった。他方ゲルの系の場合、測定範囲の上限をおよそ100 mg/Lまで広げられた。
上述の通り、アルギン酸ミクロ環境と機能強化した発光大腸菌を組合せた環境毒性の生物発光可視化のための基盤技術を確立した。
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