動物細胞分裂に同期して複製される新規rAAVの開発

• Project/Area Number: 17K07140
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Laboratory animal science
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 岡田 浩典 日本医科大学, 大学院医学研究科, 研究生 (80416271)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2017: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: rAAV / 哺乳動物用複製起点 / AAVベクター / 疾患モデル / 成体

Outline of Annual Research Achievements

個体レベルで体性幹細胞の遺伝子発現を制御する技術として、哺乳動物細胞へ感染した後に、宿主の細胞分裂に同期して複製されるゲノムを有する新規rAAV システムを開発し、希少疾患の霊長類を含めた実験動物モデルの作出を目的としている。環状変異体rAAV ゲノムに哺乳動物細胞の複製起点であるヒトIFNb 遺伝子のS/MAR 領域を持たせ、感染した宿主動物細胞の分裂に同期して複製させるコンストラクトを構築した。プラスミドとしてpUC系の複製起点を有し、大腸菌にトランスフォームすることにより増幅させ、またrAAVとしてパッケージングする際には不必要なpUC複製起点をミニサークル化により削除することにも成功した。　しかし、、哺乳動物用の複製起点となるヒトIFNb 遺伝子のS/MAR 領域が大腸菌内で複雑な構造を取るpUC系プラスミドとのプラスミド同士間でのリコンビネーションが生じる可能性がある。この対処法として、①単純に手数を増やして総量を増やす方法、② pUC系オリジンから複雑な構造に対して有効と考えられるR6Kオリジンのプラスミドへの変更を検討中である。　　その工夫の一つとしては、トランスフォームからミニサークル化、ならびにその回収までの時間を出来る限り短く抑えることである。現時点における最も単純な対処法であるが、ある程度の効果を確認した。ただし、大量にミニサークルを調達するにはかなり手間がかかるため、現在複雑な構造に対処し得ると考えられるR6Kオリジンを有するプラスミドへの変更を考慮している。この場合にはミニサークル化に必要な構成もプラスミド内に持たせる必要があり、その構成を持つプラスミドについては合成を進めた。