菌体外核酸生産菌を用いた環状RNA医薬の連続生産・回収システムの開発

• Project/Area Number: 17K07719
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Applied microbiology
• Research Institution: Toyohashi University of Technology
• Principal Investigator: 梅影 創 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (30419436)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 菊池 洋 早稲田大学, 理工学術院, 教授(任期付) (40273320)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2018: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2017: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: RNA / 菌体外生産 / ロドブルム属細菌 / 菌体外RNA / RNA生産 / AHL / クオラムセンシング / 変異 / 紫外線 / フロック / 菌体外核酸 / 連続培養

Outline of Annual Research Achievements

ロドブルム属細菌を利用した菌体外人工RNAの生産方法および回収方法の開発に関する研究として、以下のことを達成した。
１．菌体外人工RNA生産の連続生産および回収を可能とする凝集体形成変異体の作成
２．ロドブルム属細菌の菌体凝集に関与する細胞間コミュニケーション物質の同定
１については、紫外線変異導入を行い、通常では菌凝集の起こらない冨栄用条件においても菌凝集を形成する変異体を2株取得することに成功した。また、ゲノムシーケンシングにより、変異導入箇所（インデル含む）を明らかにし、どちらの変異株においても凝集に関連する遺伝子に変異が導入されていることが確かめられた。また、これらの変異株についても菌体外にRNAを生産することも示唆された。また、バッチ系ではあるが、連続培養しつつ培養液中に生産された菌体外拡散をフィルターろ過のによって回収することも確認された。従来では、菌体外核酸の回収には菌体の遠心分離は必須であったが、本変異株を用いればこれらの遠心分離操作をする必要がなく、培養量のスケールアップ化も容易になると期待される。
２については、菌間コミュニケーション物質の同定について、培養液から抽出したものについて精密質量分析を行い、新規のアシルホモセリンラクトン（3-OH-C20-HSL)を同定した。また、バイオアッセイ実験によって、この物質が確かに細胞間コミュニケーションに利用されることを明らかにした。グラム陰性細菌のアシルホモセリンラクトン類のアシル鎖長はこれまで4から18であるとされてきたが、今回の発見は、これまでの知見を大きく刷新する新たな発見となり、今後の長鎖アシルホモセリンラクトンによる菌間コミュニケーション研究のすそ野を広げることに貢献すると期待される。

Research Products

• [Journal Article] Identification of novel long chain N-acylhomoserine lactones of chain length C20 from the marine phototrophic bacterium Rhodovulum sulfidophilum (2018)
  • Author(s): N. Arashida, K. Shimbo, T. Terada, T. Okimi, Y. Kikuchi, S. Hashiro, S. Umekage* and H. Yasueda
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 82(10) Issue: 10 Pages: 1683-1693
  • DOI: 10.1080/09168451.2018.1490168
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Extracellular nucleic acid of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria (2018)
  • Author(s): Y. Kikuchi and S. Umekage
  • Journal Title: FEMS Microbiol. Lett. Volume: ３６５（３） Issue: 3 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1093/femsle/fnx268
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Involvement of the response regulator CtrA in the extracellular DNA production of the marine bacterium <i>Rhodovulum sulfidophilum</i> (2018)
  • Author(s): 15.H. Komatsu, J. Yamamoto, N. Nagao, Suzuki, T. Ohyama, S. Umekage and Y. Kikuchi
  • Journal Title: The Journal of General and Applied Microbiology Volume: 64 Issue: 3 Pages: 103-107
  • DOI: 10.2323/jgam.2017.08.003
  • NAID: 130007418024
  • ISSN: 0022-1260, 1349-8037
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research