慢性肝疾患の線維化進展におけるＭＭＰ関連因子の機能解明と抗線維化療法の開発

• Project/Area Number: 17K09407
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Gastroenterology
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 井津井 康浩 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (20401341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柿沼 晴 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (30372444) ; 朝比奈 靖浩 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座教授 (00422692) ; 渡辺 守 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (10175127)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2018: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2017: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 肝線維化 / 非アルコール性脂肪性肝炎 / 発生・分化 / 肝前駆細胞 / 細胞間相互作用 / 肝臓病学 / 再生医学 / iPS細胞 / Matrix Metalloproteinase / 脂肪性肝炎

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者らは、1. 脂肪性肝炎様マウスモデルを用いてMatrix Metalloproteinase (MMP)-2の線維化進展における機能的意義を解明すること、2. MMP-2活性を制御するMMP-14による肝星細胞の機能調節機構及び上皮細胞との相互作用を解明すること、3. MMP-2及びMMP-14により調節される因子を修飾した肝星細胞の移入による線維化改善モデルの樹立すること、4. ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞（星細胞様細胞）を誘導し、標的分子が本細胞でも同様の機能を呈する事を証明すること、の４点を目的とする研究を行い、今年度の成果として下記を得た。
MMP-14による肝星細胞の機能調節機構及び上皮細胞との相互作用の検討を行った。MMP-14欠損型胎生期肝星細胞と野生型肝芽細胞を共培養すると、胆管細胞型培養体の形成が野生型胎生期肝星細胞と比較して遅延していた。そのメカニズムを検証した結果、MMP-14欠損型細胞では消化管ペプチドに分類される特定のペプチド分泌が低下していることが示された。ペプチドのレセプターをshRNAによりknock downするとペプチドによる促進効果は認めなかった（第25会肝細胞研究会発表）。
ヒトiPS細胞から肝間葉系細胞を誘導する培養系の構築を行った。誘導したiPS由来肝間葉系細胞は、生体の肝星細胞とよく似た性質を示し、炎症刺激を加えることで筋線維芽細胞様の細胞に形質が変化した。iPS由来肝間葉系細胞は、未熟な肝細胞であるヒトiPS由来肝前駆細胞と共培養すると、成熟促進効果を呈した。転写因子LHX2を高発現させたヒトiPS由来肝間葉系細胞は、肝前駆細胞のアルブミン発現を100倍以上に上昇させるなど成熟化を強く促進した。LHX2はiPS由来肝間葉系細胞からのラミニン産生を調節し、成熟化に寄与していた（Sci Rep, 2019）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

MMP-2欠損マウスにおけるNASH様肝障害モデルにおける線維化動態の解析は、昨年度から継続して解析を進め、MMP-2欠損マウスではNASH様肝障害の誘導早期における線維形成が遅延していること、その後は野生型との差異が少なくなるものの、その状態には性差があり、性ホルモンと関連する分子群に変動があることが示された。これらの結果に基づき、今後も検討を進めてゆく予定である。
MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞の形質解析と肝幹/前駆細胞との共培養系を用いた上皮－間葉間相互作用の解析については、前記のようにMMP-14欠損型細胞では消化管ペプチドに分類される特定のペプチド分泌が低下していることが示された。この消化管ペプチドと胆管形成における関係性はこれまで既報でも明らかにされておらず新規性のある知見が得られている。現在は、消化管ペプチドの胆管形成に関与する分子機構を、分子生物学的に解明を進めており、さらに今後は、in vivoでの動態を解析する予定である。すなわち、胆管形成が進む発生過程での解析と、胆管障害と細胆管形成が進む慢性肝障害モデルでの解析を進めており、これらにも前記の消化管ペプチドが機能するデータが得られており、今後有意義な知見が得られる可能性が高いと考えている。
ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞を誘導し、分子機能を検証する系においては、ヒトiPS由来肝間葉系細胞には、未熟なiPS由来肝前駆細胞を成熟させる機能があること、その機能はLHX2発現を調節するとさらに促進されることを解明した。この結果は、ヒトiPS由来肝星細胞を利用するとヒトiPS由来肝細胞の未熟性を克服できる可能性を示し、将来的な肝再生医療への応用が期待されるとともに、遺伝子発現を調節した多様なヒトiPS由来肝星細胞を利用して研究することが今後の研究への基盤技術となることが期待される。

Strategy for Future Research Activity

前項までに記載した実績が得られている研究内容に関しては、次年度も継続して進めてゆく。
MMP-2欠損マウスにおけるNASH様肝障害モデルにおける線維化動態の解析はMMP-2欠損星細胞を正常肝、NASH様モデル線維化肝の両者からコラゲナーゼ還流法により単離し、whole transcriptome解析によって野生型マウスとの差異を明らかにする。本結果から得られた知見に基づいて、MMP-2が線維化改善に寄与し影響を与えている分子メカニズムを明らかにする。
MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞の形質解析と肝幹/前駆細胞との共培養系を用いた上皮－間葉間相互作用の解析については、消化管ペプチドの胆管形成に関与する分子機構を分子生物学的に解明するとともに、in vivoでのペプチド動態を解析する。すなわち、胆管形成が進む発生過程での解析と、胆管障害と細胆管形成が進む慢性肝障害モデルでの解析を進める。さらに、NASH様肝障害モデルを惹起したマウスに、肝間葉系細胞移入を移入し、線維化を改善せしめるモデルの樹立を進め、これにおいてMMP-14欠損型星細胞が野生型との間に有意な機能的な差を生じるか、検討を進めてゆく。
ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞を誘導し、分子機能を検証する系においては、ヒトiPS細胞株由来肝前駆細胞を胆管細胞系譜へ誘導する過程において、ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞と共培養し、いかなる形質の変化を呈するか、検討を行う。有意義な知見が得られた場合には、同様に分子生物学的な解析により、その分子機構の解明を試みる。これらの結果に基づいて、最終的にはヒト肝疾患臨床検体を利用して、in vitroで得られた結果を、臨床病態での検証解析へと進めてゆく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Impact of novel NS5A resistance-associated substitutions of hepatitis C virus detected in treatment-experienced patients. (2019)
  • Author(s): Nitta S, Asahina Y, Kato T, Tsuchiya J, Inoue-Shinomiya E, Sato A, Tsunoda T, Miyoshi M, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Kakinuma S, Hikita H, Takehara T, Watanabe M.
  • Journal Title: Scientific Report Volume: 9 Pages: 5722-5722
  • DOI: 10.1038/s41598-019-42114-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Loss of Fibrocystin Promotes Interleukin-8-Dependent Proliferation and CTGF Production of Biliary Epithelium (2019)
  • Author(s): Tsunoda T, Kakinuma S, Miyoshi M, Kamiya A, Kaneko S, Sato A, Tsuchiya J, Nitta S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Sogo T, Komatsu H, Mukouchi R, Inui A, Fujisawa T, Nakauchi H, Asahina Y, Watanabe M.
  • Journal Title: Journal of Hepatology Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2019.02.024
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] LIM homeobox 2 promotes interaction between human iPS-derived hepatic progenitors and iPS-derived hepatic stellate-like cells (2019)
  • Author(s): Miyoshi M, Kakinuma S, Kamiya A, Tsunoda T, Tsuchiya J, Sato A, Kaneko S, Nitta S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Nakauchi H, Asahina Y, Watanabe M.
  • Journal Title: Scientific Report Volume: 9 Pages: 2072-2072
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37430-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Diabetic retinopathy as a risk factor associated with the development of hepatocellular carcinoma in nonalcoholic fatty liver disease (2019)
  • Author(s): Azuma S, Asahina Y, Kakinuma S, Azuma K, Miyoshi M, Inoue E, Tsunoda T, Sato A, Kaneko S, Nagata H, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Tomita M, Nakagawa M, Watanabe M.
  • Journal Title: Digestic Disiease Volume: 37 Pages: 247-254
  • DOI: 10.1159/000493580
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Association of serum interferon-λ3 levels with hepatocarcinogenesis in chronic hepatitis C patients treated with direct-acting antiviral agents. (2019)
  • Author(s): Emi Inoue-Shinomiya, Miyako Murakawa, Yasuhiro Asahina, Mina Nakagawa, Jun Tsuchiya, Ayako Sato, Tomoyuki Tsunoda, Masato Miyoshi, Sayuri Nitta, Fukiko Kawai-Kitahata, Yasuhiro Itsui, Seishin Azuma, Sei Kakinuma, Kazumoto Murata, Masashi Mizokami, Mamoru Watanabe.
  • Journal Title: Hepatology Reserch Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.13307
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effect of interferon-based and -free therapy on early occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C (2017)
  • Author(s): Nagata H, Nakagawa M, Asahina Y, Sato A, Asano Y, Tsunoda T, Miyoshi M, Kaneko S, Otani S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Nouchi T, Sakai H, Tomita M, Watanabe M
  • Journal Title: Journal of Hepatology Volume: 67 Pages: 933-939
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2017.05.028
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ITPA gene variation and ribavirin-induced anemia in patients with genotype 2 chronic hepatitis C treated with sofosbuvir plus ribavirin (2017)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Nagata H, Nakagawa M, Kakinuma S, Nitta S, Kawai-Kitahata F, Otani S, Kaneko S, Miyoshi M, Tsunoda T, Asano Y, Sato A, Itsui Y, Azuma S, Nouchi T, Furumoto Y, Asano T, Chuganji Y, Tohda S, Watanabe M.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 印刷中 Pages: 1212-1218
  • DOI: 10.1111/hepr.12867
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hepatic IFNL4 expression is associated with non-response to interferon-based therapy through the regulation of basal interferon-stimulated gene expression in chronic hepatitis C patients (2017)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Kawai-Kitahata F, Nakagawa M, Nitta S, Otani S, Nagata H, Kaneko S, Asano Y, Tsunoda T, Miyoshi M, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka Y, Iijima S, Tsuchiya K, Izumi N, Tohda S, Watanabe M.
  • Journal Title: Journal of Medical Virology Volume: in press Pages: 1241-1247
  • DOI: 10.1002/jmv.24763
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Difference of gene mutational profile among viral- and non-viral HCC with or without prior HBV infection: Results of comprehensive deep sequencing analyses of cancer genes and HBV/AAV integration (2018)
  • Author(s): Kitahata-kawai F, Asahina Y, KakinumaS, Murakawa M, Nitta S, Nagata H, Kaneko S, Inoue E, Miyoshi M, Tsunoda T, Sato A, Nakagawa M, Itsui Y, Azuma S, Tanaka S, Tanabe M, Maekawa S, Enomoto N and Watanabe M.
  • Organizer: EASL The International Liver Congress 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒトiPS細胞由来星細胞様細胞における転写因子LHX2 の機能解析 (2018)
  • Author(s): 三好正人、柿沼 晴、金子俊、紙谷聡英、佐藤綾子、角田知之、四宮恵美、北畑富貴子、新田沙由梨、村川美也子、井津井康浩、中川美奈、東正新、朝比奈靖浩、渡辺 守.
  • Organizer: 第54回日本肝臓学会総会
• [Presentation] 肝前駆細胞による胆管形成に対する胎生期肝間葉系細胞との細胞間相互作用 (2018)
  • Author(s): 佐藤綾子、柿沼 晴、三好正人、角田知之、金子 俊、井津井康浩、東 正新、朝比奈靖浩、渡辺 守.
  • Organizer: 第25回肝細胞研究会
• [Presentation] Post-Treatment M2BPGi Level Is Useful for Predicting HCC Occurrence and Recurrence after Viral Eradication in Chronic Hepatitis C Patients. (2018)
  • Author(s): Nakagawa M, Asahina Y, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tomita M, Watanabe M.
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 免疫抑制状態によるE型肝炎慢性化症例の解析 (2018)
  • Author(s): 井津井康浩、北畑富貴子、新田沙由梨、村川美也子、中川美奈、東 正新、柿沼 晴、朝比奈靖浩、渡辺 守.
  • Organizer: 第42回日本肝臓学会東部会
• [Presentation] 免疫抑制状態でのE 型肝炎慢性化症例の解析 (2017)
  • Author(s): 井津井康浩、大谷賢志、北畑富貴子、新田沙由梨、村川美也子、中川美奈、柿沼 晴、東 正新、高橋和明、 朝比奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝臓学会総会
• [Presentation] 食餌誘導性NASH モデル マウスにおけるMatrix Metalloporoteinase-2 の機能的解析 (2017)
  • Author(s): 柿沼 晴、浅野 侑、三好正人、佐藤綾子、角田知之、金子 俊、大谷賢志、永田紘子、北畑富貴子、村川 美也子、新田沙由梨、井津井康浩、中川美奈、東 正新、朝比奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝臓学会総会
• [Presentation] LHX2 発現によるヒトiPS 由来間葉系細胞の機能調節 (2017)
  • Author(s): 三好正人、柿沼 晴、紙谷聡英、金子 俊、角田知之、佐藤綾子、浅野 侑、井津井康浩、東 正新、朝比 奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第24回肝細胞研究会
• [Presentation] 肝炎ウイルス制御下およびB 型肝炎ウイルス既往感染における肝細胞癌遺伝子変異の検討 (2017)
  • Author(s): 北畑富貴子、朝比奈靖浩、田中信二、村川美也子、新田沙由梨、柿沼 晴、永田紘子、金子 俊、浅野 侑、 角田知之、三好正人、井上恵美、佐藤綾子、井津井康浩、中川美奈、東 正新、田邉 稔、前川伸哉、榎本 信幸、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝癌研究会
• [Presentation] Evaluation of an early occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C patients treated with All-Oral DAAs -propensity score-matched analysis of a prospective database (2017)
  • Author(s): Nakagawa M, Asahina Y, Nagata H, Kaneko S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka Y, Watanabe M
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A novel culture model for coinfection of hepatitis B and hepatitis C viruses using human induced pluripotent stem cell-derived hepatic cells for analyses of changes in host-innate immune responses (2017)
  • Author(s): Kaneko S, Kakinuma S, Asahina Y, Kamiya A, Miyoshi M, Tsunoda T, Inoue-Shinomiya E, Nitta S, Sato A, Asano Y, Nagata H, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Watanabe M
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2017
  • Int'l Joint Research