慢性肝疾患の線維化進展におけるＭＭＰ関連因子の機能解明と抗線維化療法の開発

• Project/Area Number: 17K09407
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Gastroenterology
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 井津井 康浩 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (20401341)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柿沼 晴 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (30372444) ; 朝比奈 靖浩 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座教授 (00422692) ; 渡辺 守 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (10175127)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2018: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2017: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 肝線維化 / 非アルコール性脂肪性肝炎 / 発生・分化 / 肝前駆細胞 / 細胞間相互作用 / 肝臓病学 / 再生医学 / iPS細胞 / Matrix Metalloproteinase / 脂肪性肝炎

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者らは、これまでに確立してきた肝前駆細胞及び肝線維化研究の学術・技術基盤をもとに、(1)脂肪性肝炎様マウスモデルを用いたMatrix Metalloproteinase (MMP)-2の線維化進展における機能的意義を解明する。さらに、(2)MMP-2活性を制御するMMP-14による肝星細胞の機能調節機構及び上皮細胞との相互作用を解明する。これらの知見をもとに、(3)MMP-2及びMMP-14により調節される因子を修飾した肝星細胞の移入による線維化改善モデルを樹立し、ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞（星細胞様細胞）を誘導し、標的分子が本細胞でも同様の機能を呈する事を証明する研究を行い、今年度の成果として下記を得た。
MMP-2欠損マウスにコリン欠乏/メチオニン補充/高脂肪食を負荷した脂肪性肝炎様モデルにおける線維化動態の解析を行い、MMP-2欠損マウスでは、野生型マウスと比較して有意に脂肪性肝炎による線維形成が悪化すること、本機構にはTIMP1の発現亢進が関与することが示された。そのメカニズム解析としてwhole transcriptome解析を行い、数種類の発現亢進分子を発見し、その機能解析を現在行っている。
さらにMMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞の単離を行ったところ、whole transcriptome解析によってMMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞において、野生型と比較して数種類の発現低下分子を発見した。その分子の肝間葉系細胞における機能解析を現在進めている。さらに、MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞と肝前駆細胞の共培養系を用いた上皮-間葉細胞間相互作用を検討する実験系の構築と解析を行っている。これらの検討で得られた数種類の分子について、患者由来血清サンプルにおける動態の比較解析を次年度以降に行うことを計画している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、(1)脂肪性肝炎様マウスモデルを用いたMatrix Metalloproteinase (MMP)-2の線維化進展における機能的意義の解明に関しては、想定通りの進捗をみせ、その内容の一部を第５３回日本肝臓学会総会にて発表した。MMP-2欠損マウスでは、野生型マウスと比較して有意に脂肪性肝炎による線維形成が悪化することが示されたため、そのメカニズム解析としてwhole transcriptome解析を行うことで、さらに次年度以降の研究が進展できるものと考えている。
(2)MMP-2活性を制御するMMP-14による肝星細胞の機能調節機構及び上皮細胞との相互作用の解明に関しては、(1)と同様に想定通りの進捗をみせ、MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞の単離系を確立できたこと、whole transcriptome解析によってMMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞において、野生型と比較して数種類の発現低下分子を発見できたことなどが今年度実績として挙がっている。MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞と肝前駆細胞の共培養系を用いた上皮-間葉細胞間相互作用を検討する実験系の構築にも既に成功しており、さらに次年度以降の研究が進展できるものと考えている。
(3)MMP-2及びMMP-14により調節される因子を修飾した肝星細胞の移入による線維化改善モデルを樹立し、ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞（星細胞様細胞）を誘導し、標的分子が本細胞でも同様の機能を呈する事を証明する研究については、当初の計画でも、上記の解析結果を踏まえて、計画２年次以降より進行させる予定であった。前記の解析結果が順調に得られていることから考えても、当初の計画通りに概ね順調に進行しているものと考えている。

Strategy for Future Research Activity

前項に記した(1)及び(2)の研究項目に関しては、今年度の実績に基づき、さらにこれを継続して発展させて遂行する。さらに以下の内容に関して、これまでの成果を基盤に推進してゆく。
(1)脂肪性肝炎様マウスモデルを用いたMMP-2の線維化進展における機能的意義の解明：whole transcriptome解析の結果として得られた、脂肪性肝炎様モデルにおけるMMP-2欠損マウスにおける発現亢進、低下の各分子群の病態との相関解析と機能解析を行い、線維化悪化の原因となる分子機構を明らかにしてゆく。
(2)MMP-14による肝星細胞の機能調節機構及び上皮細胞との相互作用の解明：前述した対象分子群に対する阻害剤によるスクリーニング解析を経て、肝間葉系細胞に対する強制発現もしくはgene silencingによる検証実験に進む。MMP-14欠損マウス由来発生期肝間葉系細胞と肝前駆細胞の共培養系を用いた上皮-間葉細胞間相互作用を検討する実験系の構築には成功しており、上記で得られた分子群が肝前駆細胞の分化・増殖にいかなる影響を及ぼすかを本実験系を利用して検証し、さらにその分子機構を解析する。これらの検討で得られた数種類の分子について、患者由来血清サンプルにおける動態の比較解析を次年度以降に行うことを計画している。
(3)MMP-2及びMMP-14により調節される因子を修飾した肝星細胞の移入による線維化改善モデルを樹立し、ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞（星細胞様細胞）を誘導し、標的分子が本細胞でも同様の機能を呈する事を証明する研究：前項で確定した分子に関して、強制発現もしくはgene silencingを行う系を確立し、ヒトiPS細胞株由来肝間葉系細胞での機能解析へ進展させる。

Research Products

• [Journal Article] Effect of interferon-based and -free therapy on early occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C (2017)
  • Author(s): Nagata H, Nakagawa M, Asahina Y, Sato A, Asano Y, Tsunoda T, Miyoshi M, Kaneko S, Otani S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Nouchi T, Sakai H, Tomita M, Watanabe M
  • Journal Title: Journal of Hepatology Volume: 67 Pages: 933-939
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2017.05.028
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ITPA gene variation and ribavirin-induced anemia in patients with genotype 2 chronic hepatitis C treated with sofosbuvir plus ribavirin (2017)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Nagata H, Nakagawa M, Kakinuma S, Nitta S, Kawai-Kitahata F, Otani S, Kaneko S, Miyoshi M, Tsunoda T, Asano Y, Sato A, Itsui Y, Azuma S, Nouchi T, Furumoto Y, Asano T, Chuganji Y, Tohda S, Watanabe M.
  • Journal Title: Hepatol Res. Volume: 印刷中 Pages: 1212-1218
  • DOI: 10.1111/hepr.12867
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hepatic IFNL4 expression is associated with non-response to interferon-based therapy through the regulation of basal interferon-stimulated gene expression in chronic hepatitis C patients (2017)
  • Author(s): Murakawa M, Asahina Y, Kawai-Kitahata F, Nakagawa M, Nitta S, Otani S, Nagata H, Kaneko S, Asano Y, Tsunoda T, Miyoshi M, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka Y, Iijima S, Tsuchiya K, Izumi N, Tohda S, Watanabe M.
  • Journal Title: Journal of Medical Virology Volume: in press Pages: 1241-1247
  • DOI: 10.1002/jmv.24763
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 免疫抑制状態でのE 型肝炎慢性化症例の解析 (2017)
  • Author(s): 井津井康浩、大谷賢志、北畑富貴子、新田沙由梨、村川美也子、中川美奈、柿沼 晴、東 正新、高橋和明、 朝比奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝臓学会総会
• [Presentation] 食餌誘導性NASH モデル マウスにおけるMatrix Metalloporoteinase-2 の機能的解析 (2017)
  • Author(s): 柿沼 晴、浅野 侑、三好正人、佐藤綾子、角田知之、金子 俊、大谷賢志、永田紘子、北畑富貴子、村川 美也子、新田沙由梨、井津井康浩、中川美奈、東 正新、朝比奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝臓学会総会
• [Presentation] LHX2 発現によるヒトiPS 由来間葉系細胞の機能調節 (2017)
  • Author(s): 三好正人、柿沼 晴、紙谷聡英、金子 俊、角田知之、佐藤綾子、浅野 侑、井津井康浩、東 正新、朝比 奈靖浩、渡辺 守
  • Organizer: 第24回肝細胞研究会
• [Presentation] 肝炎ウイルス制御下およびB 型肝炎ウイルス既往感染における肝細胞癌遺伝子変異の検討 (2017)
  • Author(s): 北畑富貴子、朝比奈靖浩、田中信二、村川美也子、新田沙由梨、柿沼 晴、永田紘子、金子 俊、浅野 侑、 角田知之、三好正人、井上恵美、佐藤綾子、井津井康浩、中川美奈、東 正新、田邉 稔、前川伸哉、榎本 信幸、渡辺 守
  • Organizer: 第53回日本肝癌研究会
• [Presentation] Evaluation of an early occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C patients treated with All-Oral DAAs -propensity score-matched analysis of a prospective database (2017)
  • Author(s): Nakagawa M, Asahina Y, Nagata H, Kaneko S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Nitta S, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka Y, Watanabe M
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A novel culture model for coinfection of hepatitis B and hepatitis C viruses using human induced pluripotent stem cell-derived hepatic cells for analyses of changes in host-innate immune responses (2017)
  • Author(s): Kaneko S, Kakinuma S, Asahina Y, Kamiya A, Miyoshi M, Tsunoda T, Inoue-Shinomiya E, Nitta S, Sato A, Asano Y, Nagata H, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Watanabe M
  • Organizer: AASLD The Liver Meeting 2017
  • Int'l Joint Research