Research Project
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
骨格筋には筋組織特異的な幹細胞である衛星細胞（SCs: satellite cells）が存在し、SCsは筋組織の損傷時の修復・維持の過程などで中心的な役割を担っている。正常時の筋組織では、SCsは筋管と基底膜の間に存在し静止期の状態にあるが、損傷を受けた筋組織では、SCsの活性化が起こり、SCsを介した筋組織の修復が開始する。活性化したSCsは細胞増殖を開始し、非対称分裂によって筋芽細胞前駆細胞を産生する。筋芽細胞前駆細胞は増殖を繰り返した後、増殖を停止して筋芽細胞に分化する。最終的に、筋芽細胞は互いに融合して筋管となり、損傷部位の修復を行う。私たちはWnt非古典的シグナルを担うRor1が筋芽細胞で発現していることを見出した。そこで、筋芽細胞分化におけるRor1の役割を明らかにするために、Ror1の基質タンパク質の同定を計画した。そのために、野生型Ror1タンパク質のC末端（細胞質内ドメイン）にビオチンキナーゼ（BioL）を付加した融合タンパク質（Ror1 WT-BioL）、およびRor1のチロシンキナーゼ活性を欠失させた変異体タンパク質（Ror1 DK）のC末端にビオチンキナーゼを付加した融合タンパク質（Ror1 DK-BioL）を発現するプラスミド発現ベクターを構築した。これらのプラスミド発現ベクターをマウス筋芽細胞株C2C12細胞に一過的遺伝子導入を行い、ウエスタンブロッティング法を用いてRor1 WT-BioLおよびRor1 DK-BioLタンパク質の発現を確認した。さらに、プラスミド発現ベクター内のネオマイシン耐性遺伝子を利用して、これらのタンパク質を恒常的に発現するC2C12細胞の樹立を行った。今後、これらのRor1-BioL発現C2C12細胞はクローン化および筋芽細胞分化能の確認を行ったのち、Ror1の基質タンパク質同定実験の研究に利用可能である。
