血清エクソソームバイオマーカーによる腎癌早期診断実現に向けた研究

• Project/Area Number: 17K17848
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Urology; Pathological medical chemistry
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 神宮司 健太郎 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座助教 (80707571)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2018: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2017: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 腎癌 / 血清エクソソーム / エクソソーム / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

1. AZU1陽性エクソソーム(AZU1-EXO)に共局在するタンパク質の同定に先立ち、まずは細胞内においてAZU1と共局在するタンパク質の同定を行った。空ベクター安定発現ACHN細胞(Ctrl-ACHN細胞)もしくは、AZU1-FLAG安定高発現ACHN細胞(AZU1-ACHN細胞)ライセートに対してFLAG抗体で免疫沈降を行った。得られた免疫沈降済みサンプルをSDS-PAGEにより展開し、銀染色を行った。Ctrl-ACHN細胞よりもAZU1-ACHN細胞のサンプルにおいてより強く検出されたバンドを切り出し、トリプシン消化後に、質量分析による網羅的タンパク質解析を行った。その結果、AZU1結合候補タンパク質を複数同定した。今後、質量分析で得られた結果をそれぞれの候補タンパク質に対する抗体を用いて、AZU1との会合を免疫沈降実験により検証していく。
2. The Cancer Genome Atlasの情報より、腎癌細胞以外の癌種においてもAZU1 mRNAレベルでの高発現が認められていたので、ウェスタンブロット法によりタンパク質レベルでも同様に発現しているか否か検証した。その結果、乳癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、肺癌細胞株においてAZU1タンパク質の発現が認められた。
3. 空ベクター安定発現ACHN細胞(Ctrl-ACHN細胞)もしくは、AZU1-FLAG安定高発現ACHN細胞(AZU1-ACHN細胞)をBALB/C ヌードマウスに皮下移植し、腫瘍成長後に血清を回収した。得られた血清をテトラスパニン抗体とAZU1抗体を用いてサンドイッチELISAを行い、血清中AZU1陽性エクソソームの検出を試みた。その結果、Ctr-ACHN細胞移植マウス血清と比較してAZU1-ACHN細胞移植マウス血清において、AZU1陽性エクソソームを検出することに成功した。

Research Products

• [Journal Article] Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin (2017)
  • Author(s): Jingushi Kentaro、Uemura Motohide、Ohnishi Naomi、Nakata Wataru、Fujita Kazutoshi、Naito Takuya、Fujii Risa、Saichi Naomi、Nonomura Norio、Tsujikawa Kazutake、Ueda Koji
  • Journal Title: International Journal of Cancer Volume: 142 Issue: 3 Pages: 607-617
  • DOI: 10.1002/ijc.31080
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 糖鎖修飾はａｚｕｒｏｃｉｄｉｎのＥＶへの搭載に重要である (2017)
  • Author(s): 神宮司 健太郎、植村 元秀、植田 幸嗣、藤田 和利、河嶋 厚成、氏家 剛、辻川 和丈、野々村 祝夫
  • Organizer: 第76回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Glycosylation promotes azurocidin sorting into EVs in clear cell renal cell carcinoma cells. (2017)
  • Author(s): Jingushi K, Naito T, Uemura M, Ueda K, Fujita K, Nonomura N, Tsujikawa K
  • Organizer: ISEV 2017
  • Int'l Joint Research