| Project/Area Number |
18038006
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 卓也 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)
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| Project Period (FY) |
2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | 生体外蛋白質合成系 / 進化工学 / 蛋白質相互作用 / リボソーム / 終結因子 / 抗体 |
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| Research Abstract |
リボソームディスプレー法(RD法)を行う場合、リボソーム三者複合体の形成効率が極めて重要なポイントとなる。そこでまず、形成効率に影響するC末端側コンストラクトの検討を行った。HyHEL10scFv(リゾチーム特異的抗体)の下流に、リボソーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されているSecMのアレスト配列を導入することで、RDにおけるmRNAの効率が上昇するという新しい知見を得るに至った。これはSecM導入によるリボソーム複合体の形成効率向上によるものであると考えられ、特にPURESYSTEMではSecMのストールを不安定化するtmRNAなどが存在しないため有効な方法であると推測された。また、PURESYSTEMは因子の有無など環境を自由に設計できるため、これまでの細胞抽出系を用いた場合では不可能であったシステムの詳細な素過程解析を行うことが可能である。「mRNA-リボソーム-蛋白質複合体」の形成に必須な各因子(EF、リボソーム、mRNA)をRD系中から出し入れし、HyHEL10とDHFRとの1:30からのセレクション(リガンドとしてリゾチームを使用)を行ったところ全ての因子が存在する場合にのみ、HyHEL10の特異的選択がみられ、「mRNA-リボソーム-蛋白質複合体による目的分子の特異的選択」というRD法の基本概念を、PURESYSTEMを用いることで実験的に確認することが出来た。さらに、scFvの特異的選択系において、細胞抽出液の無細胞蛋白質合成系を用いた場合よりもPURESYSTEMを用いた場合の方が、高効率に選択されることを実験的に確認した。また、本方法では1ラウンドのセレクションにおいて、目的分子を12000倍以上に濃縮できることを確認した。これまで報告されているRD法では1000倍以下の濃縮効率である。さらに、プールとして、10^<10>から10^<11>倍の非結合性のタンパク質遺伝芋で希釈しても、目的の抗体遺伝子が、3回から5回の選抜で単離可能なことがしめされ、これは本方法の有効性を示すものであると考えられる。さらに、抗原の固定について、PURE systemを用いて非天然アミノ酸を導入して効率よく固定する手法を開発した。
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