ゲノムDNA単分子解析と細胞サイズベシクル中での生化学実験

• Project/Area Number: 18048007
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小穴 英廣 The University of Tokyo, 大学院・工学系研究科, 講師 (20314172)
• Project Period (FY): 2006 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000); Fiscal Year 2007: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2006: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ゲノムDNA / オプティカルマッピング / 光ピンセット / PNA / 三重鎖(triplex)

Research Abstract

本研究では、一つの細胞からDNAを切断することなく取り出し、顕微鏡下でオプテイカルマッピングを行い、探索したい塩基配列の有無、存在する場合はどの位置にあるかを迅速に明らかにするという解析手法の確立を目指している。具体的には超好熱始原菌をもちいて本手法の有用性を示すと共に超好熱始原菌研究に有用な情報を提供する事を目指している。
本年度は、超好熱始原菌KOD1株のゲノムDNA(全長約680um)に対し、断片化させることなく単分子オプティカルマッピングを行うことを目指し、研究を進めた。KOD1ゲノムDNAを浸透圧ショックによる細胞破壊で取り出した後、蛍光標識オリゴPNAプローブを導入して複製開始領域の特定塩基配列部とPNAとで三重鎖を形成させ、ゲノムDNA分子を光ピンセットで伸展させてオプティカルマッピングを行った。オリゴPNAプローブは、KOD1ゲノムDNAの複製開始領域を認識するようにデザインし、蛍光標識にはQdot用いた。前年度、一部伸展されたDNAの鎖上にQdotの輝点を確認する事に成功していたが、蛍光プローブの非特異吸着の問題が認められていた。本年度は実験プロトコルを改良し、非特異吸着を押さえつつ、十分な量の解析サンプルを得ることに成功した。

Research Products

• [Journal Article] Visualization of an oriC region on an isolated single whole-genome DNA with triplex forming PNA probe using fluorescence microscopy (2007)
  • Author(s): Y. Mori, H. Oana, H. Atomi, T. Imanaka, M. Washizu
  • Journal Title: 2007 IEEE International Symposium on Micro-Nano Mechatronics and Human Science (MHS 2007) 1 Pages: 79-84
• [Presentation] ゲノムDNA複製開始領域の単分子オプティカルマッピング (2007)
  • Author(s): 森泰啓, 小穴英廣, 跡見晴幸, 今中忠行, 鷲津正夫
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム研究会(CHEMINAS)
  • Place of Presentation: 仙台(東北大学)
  • Year and Date: 2007-05-25
• [Book] ゲノムDNAの単分子操作(バイオプロセスを利用した有用物質生産技術ハンドブック) (2007)
  • Author(s): 寺尾京平, 小穴英廣, 鷲津正夫(分担執筆)
  • Publisher: ブッカーズ(1月発行予定)