機能中の蛋白質の動的立体構造解析:新たな電子線3次元画像処理法および標識法の応用

• Project/Area Number: 18054007
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 片山 栄作 The University of Tokyo, 医科学研究所, 教授 (50111505)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上田 太郎 産業技術総合研究所, セルエンジニアリング, 研究グループ長 (90356551)
• Project Period (FY): 2006 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥7,600,000 (Direct Cost: ¥7,600,000); Fiscal Year 2007: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2006: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
• Keywords: 分子モーター / アクトミオシン / 滑り運動 / 急速凍結レプリカ電子顕微鏡 / 構造差分解析法 / レバーアーム首振り / 顕微鏡標識法 / 1分子の構造生物学

Research Abstract

熱揺動下で確率的に働く蛋白質分子機械の作動原理を探るには機能中の1分子を瞬間的に固定して可視化処理を行い、一切の平均化なしにその挙動と物性を解析するのが理想である。本課題では、個々の分子のサブドメイン構造まで直接観察できる強力な電子顕微鏡法で機能遂行中の超分子複合体の一瞬の姿を捉え、その3次元構造解析のための新技術を駆使して機械の作動機序を原子モデルの動画として示す「1分子の構造生物学」の実現を目指した。
筋収縮の分子機構として世界の大部分は、強く屈曲したATP結合型ミオシンのレバーアームがADP解離とともに伸展する際にアクチンの滑りが起きるという「レバーアーム首振り説」を信じる。われわれは高い分解能とコントラストで個々の蛋白質分子の実像を得られる急速凍結フリーズレプリカ法により運動中のアクトミオシンの姿を捉えた。試料表面の凹凸に依る陰影を分子の原子モデルに基づく多数の仮想画像と比較し、当該粒子のコンフォメーションと投影角を精密に識別できる構造差分解析法を擁して解析した結果、運動中の頭部は分子内SH基を化学架橋した分子種に酷似し、従来説のATP結合型とは逆に屈曲していることが判明した。そこでその粒子のレプリカ像を集めて組分け、平均化して立体構造を推定した。さらに、滑り運動中にはその構造が大部分を占め、同じ形状の頭部がアクチン表面を撫でる動きと、その後その構造を保ったまま大きく向きを変えて最終的に硬直複合体に至る伸展運動の2種の動きを行う可能性を示した。後者がADP/Pi放出を伴う張力発生過程で前者は低負荷の際にだけアクチンを変位させる未知の機序と仮定すれば、それらの割合を変えることで観察された全ての画像や従来の実験結果を説明できる。一方で、棒状構造を有する標識を対象蛋白質に付加する手法を開発した。目的の蛋白質への直接融合により対象の特定部位の局在や向きに関する情報が得られる。

Research Products

• [Journal Article] 人間の視覚処理を模した新たな顕微鏡画像処理法. (2008)
  • Author(s): 木森義隆、片山栄作
  • Journal Title: 「生物物理」 48 Pages: 125-130
  • NAID: 110006640409
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A procedure to analyze surface profiles of the protein molecules visualized by quick-freeze deep-etch replica electron microscopy. (2007)
  • Author(s): Y. Kimori, Y. Oguchi, N. Baba & E. Katayama
  • Journal Title: Ultramicroscopy 107 Pages: 25-29
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel "ghost-free" tomographic image reconstruction method applicable to rotary-shadowed replica-type specimens. (2007)
  • Author(s): N. Baba & E. Katayama
  • Journal Title: Ultramicroscopy 108 Pages: 239-255
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] gelsolin精製におけるアニオン交換グラフト鎖搭載多孔性膜とアニオン交換ビーズカラムとの性能比較 (2007)
  • Author(s): 吉川 聖、萩原恭平、斉藤恭一、片山栄作、東條 正、須郷高信
  • Journal Title: 「日本イオン交換学会誌」 18 Pages: 2-8
  • NAID: 130004061613
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 電子顕微鏡・ナノワールドを読み解くパワフル技術』分子を見る:電子顕微鏡による蛋白質複合体の観察法 (2007)
  • Author(s): 片山栄作
  • Journal Title: 「細胞工学」 26 Pages: 438-443
• [Journal Article] A procedure to analyze surface profiles of the protein molecules visualized by quick-freeze deep-etch replica electron microscopy (2007)
  • Author(s): Kimori, Y, Oguchi, Y., Ichise, N., Baba, N., Katayama, E.
  • Journal Title: Ultramicroscopy 107 Pages: 25-39
• [Journal Article] 連載『電子顕微鏡・ナノワールドに橋を架ける技術』分子を見る : 電子顕微鏡による蛋白質複合体の観察法 (2007)
  • Author(s): 片山栄作
  • Journal Title: 細胞工学 26 Pages: 438-443
• [Journal Article] Cargo-binding makes a wild-type single-headed myosin-VI move Processively (2006)
  • Author(s): Iwaki, M., Tanaka, H., Iwane, A.H., Katayama, E., Ikebe, M., Yanagida, T.
  • Journal Title: Biophysical Journal 90 Pages: 3643-3652
• [Journal Article] Microtubule-severing activity of Shigella is pivotal for intercellular spreading (2006)
  • Author(s): Yoshida, S., Handa, Y., Suzuki, T., Ogawa, M., Suzuki, M., Tamai, A., Abe, A., Katayama, E., Sasakawa, C.
  • Journal Title: Science 314 Pages: 985-989
• [Presentation] Key-Intermediate in Actomyosin Crossbridge-Cycle during Sliding: A Candidate for Pre-Power Stroke Configuration (2008)
  • Author(s): E. Katayama Y. Kimori, N. Baba, T. Q P Uyeda
  • Organizer: 52nd Annual Meeting of Biophysical Society
  • Place of Presentation: Long Beach Gonvention Center, California
• [Presentation] アクチン滑り運動中のミオシン頭部コンフォメーションの解析 (2007)
  • Author(s): 片山栄作 木森義隆 上田太郎
  • Organizer: 日本生物物理学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2007-12-21
• [Presentation] 機能中の蛋白質の動的立体構造解析:新たな電子線3次元画像処理法および標識法の応用 (2007)
  • Author(s): 木森義隆、馬場則男、上田太郎、片山栄作
  • Organizer: 特定領域研究「生体超分子構造」第4回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 大阪バイオサイエンスセンター
  • Year and Date: 2007-12-18
• [Presentation] アクトミオシン滑り運動の分子機構:新たなクロスブリッジ・サイクルの提案 (2007)
  • Author(s): 片山栄作 木森義隆 馬場則男 上田太郎
  • Organizer: 東京大学ネットワークシンポジウム
  • Place of Presentation: 安田講堂
  • Year and Date: 2007-09-15
• [Presentation] 機能中の蛋白質の動的立体構造解析:新たな電子線3次元画像処理法および標識法の応用 (2007)
  • Author(s): 片山栄作、木森義隆、馬場則男、上田太郎
  • Organizer: 特定領域研究「生体超分子の構造形成と機能制御の原子機構」第3回ワークショップ
  • Place of Presentation: オテルアカオ(熱海)
  • Year and Date: 2007-07-11
• [Presentation] 電子/光学顕微鏡に兼用できる新たな高精度分子標識目ジュールの開発と応用 (2007)
  • Author(s): 片山栄作 村山 尚 冨永基樹 岩井草介 小林琢也 上田太郎
  • Organizer: 日本顕微鏡学会年会
  • Place of Presentation: ときメッセ(新潟)
  • Year and Date: 2007-05-19
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子モジュール (2007)
  • Inventor(s): 片山栄作、村山尚、樫山拓、小林琢也
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Filing Date: 2007-12-05
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 立体画像再構成処理装置検証装置、画像処理方法、記録媒体など (2007)
  • Inventor(s): 片山栄作、木森義隆、馬場則男
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Acquisition Date: 2007-12-11
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 回転式モルフオロジ-フィルタ-及びそれを用いた画像処理法 (2006)
  • Inventor(s): 片山栄作, 木森義隆, 馬場則男
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Filing Date: 2006-10-13
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子モジュール (2006)
  • Inventor(s): 片山栄作, 村山 尚, 樫山 拓, 小林琢也
  • Industrial Property Rights Holder: 東京大学
  • Filing Date: 2006-12-08