開口放出で働く繋留因子Exocyst複合体の立体構造解析

• Project/Area Number: 18054009
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo (2007); Tokyo Institute of Technology (2006)
• Principal Investigator: 深井 周也 The University of Tokyo, 放射光連携研究機構, 准教授 (10361792)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀内 久徳 京都大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90291426)
• Project Period (FY): 2006 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥6,300,000 (Direct Cost: ¥6,300,000); Fiscal Year 2007: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2006: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
• Keywords: X線結晶構造解析 / 電子顕微鏡 / 超分子複合体 / 小胞輸送 / 低分子量GTPase / 開口放出 / 膜融合

Research Abstract

生体試料から調製したExocyst複合体やサブ複合体はサブユニット構成が不明であり、現段階では単粒子解析による立体像の決定は難しい。しかし、組み換えタンパク質を用いて再構成した複合体の像との比較によって、生体試料から得られた像の解釈が可能になると考えられる。バキュロウイルスの発現系を用いて複合体の再構成を行うべく、組み換えベクターの構築を進めた。今年度は、ラットの4つのサブユニット、ショウジョウバエの7つのサブユニットをバクミド組換え用のベクターに組込み終えた。Exocystの構造解析を進めると共に、研究分担者の京大医・堀内久徳講師との共同研究によりExocyst複合体とRalとの相互作用が血小板の顆粒放出を制御していることを新たに示した。また、Ralの新規結合タンパク質の同定・解析も進めた。出芽酵母のExocyst複合体は、Sec15pサブユニットを介して、酵母のRab GTPase Sec4pとその活性化タンパク質であるグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)Sec2pと相互作用する。我々は、まず、Sec2pのGEFドメインの結晶構造を3.0Å分解能で決定し、GEF反応が180Åの長さの単純なコイルドコイル構造によって行われることを明らかにした。さらに、欠失変異体や点変異体を使った結合アッセイおよびGEFアッセイにより、Sec4p結合サイトと結合に必要なアミノ酸残基を特定した。GEFドメイン単独の結晶構造と生化学的解析の結果に基づいて発現系を設計し、Sec2pのGEFドメインとSec4pの複合体の結晶構造を2.7Å分解能で決定し、ヌクレオチドの解離を促進させるSec4pのスイッチ領域の大きな構造変化が複合体形成によって引き起こされる仕組みを原子分解能レベルで明らかにした。

Research Products

• [Journal Article] Biochemical characterization of the Rho GTPase-regulated actin assembly by diaphanous-related formins, mDia1 and Daam1, in platelets (2008)
  • Author(s): Higashi, T. Ikeda, T., Shirakawa, R., Kondo, H., Kawato, M., Horiguchi, M. Okuda, T., Okawa, K., Fukai, S., Nureki, O., Kita, T., Horiuchi, H.
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry 283 Pages: 8746-8755
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulation of platelet dense granule secretion by the Ral GTPase-Exocyst pathway (2008)
  • Author(s): Kawato, M., Shirakawa, R., Kondo, H., Higashi, T., lkeda, T., Okawa, K., Fukai, S., Kita, T., Horiuchi, H.
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry 283 Pages: 166-174
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of human DAAM1 formin homology 2 domain (2007)
  • Author(s): Yamashita, M., Higashi, T., Suetsugu, S., Sato, Y., Ikeda, T., Shirakawa, R., Kita, T., Takenawa, T., Horiuchi, H., Fukai, S., Nureki, O.
  • Journal Title: Genes to Cells 12 Pages: 1255-1265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the Sec2p-Sec4p complex in the intermediate state of the nucleotide exchange reaction (2007)
  • Author(s): Sato, Y., Fukai, S., Ishitani, R., Nureki, O.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104 Pages: 8305-8310
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and crystallographic analysis of yeast Sec2p, aguanine nucleotide-exchange factor for the yeast Rab GTPase Sec4p (2007)
  • Author(s): Sato, Y., Fukai, S., Nureki, O.
  • Journal Title: Acta Crystallographica F 63 Pages: 616-619
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] tructural basis for sulfur relay to RNA mediated by heterohexameric TusBCD complex (2006)
  • Author(s): T.Numata, S.Fukai, Y.Ikeuchi, T.Suzuki, O.Nureki
  • Journal Title: Structure 14 Pages: 357-366
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the tRNA thiolation enzyme MnmA from Escherichia coli complexed with tRNA^<Glu> (2006)
  • Author(s): T.Numata, Y.Ikeuchi, S.Fukai, H.Adachi, H.Matsumura, K.Takano, S.Murakami, T.Inoue, Y.Mori, T.Sasaki, T.Suzuki, O.Nureki
  • Journal Title: Acta Crystallographica F 62 Pages: 368-371
• [Journal Article] Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction of SecDF, a translocon-associated membrane protein, from Thermus thermophilus (2006)
  • Author(s): T.Tsukazaki, H.Mori, S.Fukai, T.Numata, A.Perederina, H.Adachi, H.Matsumura, K.Takano, S.Murakami, T.Inoue, Y.Mori, T.Sasaki, D.G.Vassylyev, O.Nureki, K.Ito
  • Journal Title: Acta Crystallographica F 62 Pages: 376-380
• [Journal Article] Structural basis of RNA-dependent recruitment of glutamine to the genetic code (2006)
  • Author(s): H.Oshikane, K.Sheppard, S.Fukai, Y.Nakamura, R.Ishitani, T.Numata, R.L.Sherrer, L.Feng, E.Schmitt, M.Panvert, S.Blanquet, Y.Mechulam, D.Soll, O.Nureki
  • Journal Title: Science 3122 Pages: 1950-1954
• [Journal Article] Snapshots of tRNA sulphuration via an adenylated intermediate (2006)
  • Author(s): T.Numata, Y.Ikeuchi, S.Fukai, T.Suzuki, O.Nureki
  • Journal Title: Nature 442 Pages: 419-424
• [Journal Article] Complete crystallographic analysis of the dynamics of CCA-addition (2006)
  • Author(s): K.Tomita, R.Ishitani, S.Fukai, O.Nureki
  • Journal Title: Nature 443 Pages: 956-960
• [Journal Article] Crystal structures of leucyl/phenylalanyl-tRNA-protein transferase and its complex with an aminoacyl-tRNA analog (2006)
  • Author(s): K.Suto, Y.Shimizu, K.Watanabe, T.Ueda, S.Fukai, O.Nureki, K.Tomita
  • Journal Title: EMBO Journal 25 Pages: 5942-5950
• [Journal Article] Asymmetric coiled-coil structure with guanine nucleotide exchange activity (2006)
  • Author(s): Y.Sato, R.Shirakawa, H.Horiuchi, N.Dohmae, S.Fukai, O.Nureki
  • Journal Title: Structure 15 Pages: 245-252
• [Presentation] 開口放出を制御するRabGTPase Sec4p活性化の構造的基盤 (2007)
  • Author(s): 深井 周也
  • Organizer: BMB2007
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
• [Presentation] Rhoによって制御される細胞質中のForminタンパク質によるアクチン重合 (2007)
  • Author(s): 東 智仁
  • Organizer: BMB2007
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
• [Presentation] RalGAPの同定 (2007)
  • Author(s): 白川 龍太郎
  • Organizer: BMB2007
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜