水疱性類天疱瘡病的抗原に対するヒト型モノクローナル抗体の作成と治療への応用

Research Project

Project/Area Number	18591230
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Research Field	Dermatology
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	王剛北大 (30419957)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	芝木晃彦北海道大学, 北海道大学病院, 講師 (40291231) 澤村大輔弘前大学, 医学部, 教授 (60196334)
Project Period (FY)	2006 – 2007
Project Status	Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help	¥3,950,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2007: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2006: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	皮膚病理学 / 免疫 / 治療 / 臨床 / 細胞・組織
Research Abstract	本研究では、自己免疫疾患の新規治療法として、最も頻度の高い自己免疫性皮膚疾患である水疱性類天疱瘡(BP)をターゲット疾患とし、BP患者末梢血より阻害型ヒトモノクローナルFab抗体をより迅速に作成する。平成18年度は、本研究ヘエントリーするBP患者の選択、末梢血、血清の解析を行い、選択された患者から末梢血単核球を採取し、mRNAを抽出、cDNAレパトアを作成、ファージ抗体ライブラリーの作成を行った。高力価の自己抗体を有するBP患者2名から採取した末梢血から自己抗体産生B細胞を含む単核球を得た。得られた単核球からmRNAを抽出した後、PCRにてIgGのFab領域に対応する領域を増幅して抗体cDNAライブラリーを作製した。p3MHベクターにクローニングした後、大腸菌に感染させて、ファージ抗体ライブラリーを作製した。作成したファージ抗体ライブラリーを、組み換えヒトNC16Aを固相化したプレートを用いたパンニング法にてポジティブファージクローンを回収した。パンニングを2〜4度繰り返し、組み換えヒトNC16Aに対する抗原特異性の高いファージ抗体クローンを選択した。得られたファージ抗体クローンから制限酵素を用いてgeneIII領域を除去、セルフライゲーションした後に大腸菌に形質転換し、上清中に溶出したFab抗体を遠心分離にて回収した。得られたFab抗体を、組み換えヒトNC16A1-3蛋白質、組み換えヒトNC16A1蛋白質、組み換えヒトNC16A2蛋白質、組み換えヒトNC16A2.5蛋白質及び組み換えヒトNC16A3蛋白質が固相化されたプレートを用いて、HRP標識抗ヒトλ鎖抗体あるいはHRP標識抗ヒトκ鎖抗体を用いたELISA法により、エピトープマッピングを行った。その結果、NC16A2とNC16A2.5に対し反応性が高いことが判明した。