アーキアにおけるtRNA修飾システムの解明

• Project/Area Number: 18658031
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied microbiology
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 東端 啓貴 Toyo University, 生命科学部, 准教授 (20344864)
• Project Period (FY): 2006 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2007: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2006: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: アーキア / tRNA / tRNA修飾酵素

Research Abstract

アーキオシン生合成経路を、生化学的手法を用いて明らかにする試みの他に、分子遺伝学的手法も考慮に入れた実験を計画した。アーキアにおいて遺伝子破壊系が確立されているThermococcus kodakaraensisのTGT遺伝子と候補遺伝子のクローン化を試みた。T.kodakaraensisから染色体DNAを調製し、それを鋳型にPCRを行うことで両遺伝子断片を取得した。さらに、発現ベクターpET-11aに組込み、大腸菌内での大量発現を試みたところ、両タンパク質の可溶性画分への発現を確認できた。次に、大腸菌細胞抽出液を熱処理することで、両タンパク質の耐熱性を評価した。両タンパク質は熱処理後(85℃、15分間)の上清に存在していたことから、耐熱性を保持していると考えられた。熱処理後(75℃、15分間)の各上澄み液を用いて精製条件を決定した。TGTを、RESOURCE PHE、HiTrap DEAEFF、RESOURCE Qカラムに供することで精製した。候補タンパク質を、RESOURCE ETH、HiTrap DEAEFF、RESOURCE Qカラムに供することにより精製した。両タンパク質ともに、SDS-PAGEゲル上で単一バンド(CBB染色)になるまで精製することができた。今後、それぞれの酵素活性を確認していくとともに、TGTおよび候補遺伝子断片を用いて遺伝子破壊用プラスミドを構築し、遺伝子破壊株を作製する予定である。