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相同性の低いファミリー酵素間でいかにして機能性の高いキメラ酵素を作るか

Research Project

Project/Area Number 18658043
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Applied biochemistry
Research InstitutionKochi University

Principal Investigator

大西 浩平  Kochi University, 総合研究センター, 准教授 (50211800)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 八木 年晴  高知大学, 農学部, 教授 (90110759)
Project Period (FY) 2006 – 2007
Project Status Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help
¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2006: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywords酵素 / 進化 / バイオテクノロジー
Research Abstract

既存タンパク質の部分配列を混ぜ合わせたキメラタンパク質ライブラリーの作製は、相同性の高いファミリー酵素間で行われてきた。相同性の低いファミリータンパク質(酵素)同士からでも、効率的にキメラ酵素を作り出すための手法を開発することを目的として研究を行っている。FAD依存のオキシドリダクターゼファミリーの中で、ベンゼン環を持つ化合物への水酸基導入に関与した性質の異なる2種類の酵素(相同性30%以下)をモデル酵素として用いた。
1.異なるベクター上にクローン化した2種類のオキシドリダクターゼファミリー遺伝子(M.loti MAFF303099 ubiHとP.putida PpG7 nahG)の間で、我々が開発したin vivoシャフリングを利用して相同組換えを行った。相同性の高いbphC間でのin vivoシャフリングと違ってキメラ遺伝子の形成効率が著しく低いことが明らかとなった。また、得られたキメラ遺伝子の塩基配列を調べたところ、いずれかの親酵素遺伝子と同じ配列を持つものが大部分であった。この原因については不明であるが、従来行ってきたtwo-way ligationの代わりにthree-way ligationによって直鎖上DNAの作成を行った。しかしながら、キメラ遺伝子の割合を上昇させることはできなかった。
2.得られたキメラ遺伝子を活性測定のための大腸菌HMS174に導入し、酵素活性を親酵素であるMHPC、 salicylate hydroxylaseの基質である5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸を用いて測定した。キメラ酵素の評価系として、プレートリーダーと96穴マイクロタイタープレートを利用したハイスループット系を開発した。細胞抽出液に5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸のそれぞれを加え、NADHの減少で測定したMHPC、salicylate hydroxylase活性の割合を指標にキメラ酵素を評価した。いずれも活性が検出されないか親酵素に比べて著しく低いものであった。

Report

(2 results)
  • 2007 Annual Research Report
  • 2006 Annual Research Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2008 2007 2006

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] Crystal structure of pyridoxamine-pyruvate aminotransferase from Mesorhizobium loti MAFF3030992008

    • Author(s)
      Yoshikane Y., Yokochi N., Yamasaki M., Mizutani K., Ohnishi K., Mikami B., Hayashi H., Yagi T.
    • Journal Title

      J.Biol.Chem 283

      Pages: 1120-1127

    • NAID

      120001671535

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Gene identification and characterization of the pyridoxine degradative enzyme 4-pyridoxic acid dehydrogenase from the Nitrogen-fixing symbioticbacterium Mesorhizobium loti MAFF3030992008

    • Author(s)
      Ge F., Yokochi N., Yoshikane Y., Ohnishi K., Yagi T.
    • Journal Title

      J.Biochem (印刷中)

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Directed evolution of extradiol dioxygenase by a novel in vivo DNA shuffling.2006

    • Author(s)
      Xu S., Ju J., Misono H., Ohnishi K.
    • Journal Title

      Gene 368

      Pages: 126-137

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] Identification of a new tetrameric pyridoxal 4-dehydrogenase as the sccond enzyme in the degradation pathway for pyridoxine in a nitrogen-fixing symbiotic bacterium, Mesorhizobium loti.2006

    • Author(s)
      Yokochi N., Nishimura S., Yoshikane Y., Ohnishi K., Yagi T.
    • Journal Title

      Arch Biochem Biophys 452(1)

      Pages: 1-8

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] Molecular cloning, identification and characterization of 2-methyl-3-hydroxypyridine-5-carboxylic- acid-oxygenase-coding gene from nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti.2006

    • Author(s)
      Yuan B., Yokochi N., Yoshikane Y., Ohnishi K., Yagi T.
    • Journal Title

      J. Biosci. Bioeng. 102(6)

      Pages: 504-510

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Presentation] 進化分子工学を用いた細菌アラニンラセマーゼの高機能化2007

    • Author(s)
      大西 浩平、鞠 建松、味園 春雄
    • Organizer
      生物物理学会四国支部会
    • Place of Presentation
      徳島文理大学
    • Year and Date
      2007-06-16
    • Related Report
      2007 Annual Research Report

URL: 

Published: 2006-04-01   Modified: 2016-04-21  

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