| Project/Area Number |
18659224
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Circulatory organs internal medicine
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
王 英正 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50372579)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上山 知己 京都大学, 医学研究科, 助手 (80379388)
原田 光一郎 京都大学, 医学研究科, 助手 (30402902)
小形 岳寛 京都大学, 医学研究科, 研究員 (10402877)
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| Project Period (FY) |
2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
Fiscal Year 2006: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
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| Keywords | 細胞融合 / 体性幹細胞 / 胚性幹細胞 / 再プログラム / 心筋細胞再生 / テロメア |
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| Research Abstract |
増幅能が限られている体性幹細はテロメア関連伝子導入によって不死化する試みがされているが、遺伝子をベースにした方法では常に悪性腫瘍化する危険性が付きまとう。そこで、申請者らはES細胞との細胞融合によって、ES細胞が持つ極めて高い増殖性の性質を申請者らが単離に成功した心筋幹細胞に形質伝承する目的で、Cre-loxPシステムを利用したレトロウイルスベクターを作成した。ES細胞と融合によって形質変換した細胞の精製によって、心筋幹細胞クローンにCre-IRES-RFPレトロウイルスを感染させ、ウイルス感染が良好であることを確認した。
(1)puro/hygroの抗生剤選択で純化したハイブリッド細胞が4倍体であることをFACSで確認した。融合した心筋細胞は免疫組織染色にて、心筋幹細胞には発現していないES細胞特異的な転写因子の提示を認め、細胞融合の効率がその後の解析に有効な頻度(約50%)で生じていることを検証した。
(2)RNAを回収しマイクロアレイによる網羅的検索によって、未分化ES細胞特異的転写因子や細胞周期調節因子について網羅的検索を行ったところ、約6割の心筋幹細胞特異的遺伝子の発現減少とそれに伴うES細胞固有因子の増加を融合した新規細胞の遺伝子プロファイルにて確認した。このことは、細胞融合によって心筋幹細胞が完全に形質変換したことを直接証明するものではなく、細胞融合前の約6割の心筋幹細胞がES細胞との再プログラムによる修飾の影響を受けたことを強く示唆した。
(3)neo耐性遺伝子を持つalpha-MHC-EGFPを導入したES細胞の形質を継承した再プログラムされた心筋幹細胞は、in vitroにて通常のES細胞に比べ、心筋細胞に分化する効率が約3倍向上したことをEGFPの発現頻度にて確認された。逆に融合した心筋幹細胞は正常のES細胞と比し、細胞増殖能が約半分に低下した。このことは、ES細胞の持つ多能性分化能を再プログラムする手法を用いて、遺伝子工学的に幹細胞の運命を制御したことを証明し、今後の虚血心への融合細胞移植実験にて、生体内での心筋細胞再生医療への有用性について研究を発展させていく予定である。
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