シェーグレン症候群患者の自己抗体を用いた組織障害蛋白遺伝子のクローニング

Research Project

Project/Area Number	18659610
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Surgical dentistry
Research Institution	Matsumoto Dental University
Principal Investigator	上松隆司 Matsumoto Dental University, 大学院・歯学独立研究科, 准教授 (40203476)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山岡稔松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50064671) 上松節子大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (80271378) 高橋昌宏松本歯科大学, 歯学部, 助教 (90340059) 堂東亮輔松本歯科大学, 歯学部, 助教 (40329470) 内橋隆行松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70397628) 松浦隆松本歯科大学, 歯学部, 講師 (10298408)
Project Period (FY)	2006 – 2007
Project Status	Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help	¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000) Fiscal Year 2007: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2006: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	シェーグレン症候群 / 自己抗体 / 遺伝子 / クローニング / 遺伝子クローニング
Research Abstract	シェーグレン症候群におけるリンパ球の浸潤・増殖やγグロブリン産生機構のほか、唾液腺導管上皮の萎縮や破壊を誘導する自己抗体とその抗原(組織障害抗原蛋白)の由来は明らかにされていない。シェーグレン症候群の病態を克服するためには、治療の分子標的となる組織障害抗原蛋白とその抗原提示機序を明らかにすることが必須である。そこで、治療分子標的となりうる唾液腺組織障害抗原蛋白を明らかにすることを目的とし、1、シェーグレン患者の自己抗体の精製、2、自己抗体が認識している組織障害蛋白の唾液腺組織内での局在を検討した。まず、患者血清を用いてProtein-Aビーズでγ-グロブリンを結合させ、その後エルーションを行ってγ-グロブリンを精製した。これらの免疫グロブリンは、少量ずつ分注して使用するまで-25度に保存した。免疫組織染色を行うために、正常唾液腺(顎下腺、口唇腺等)とシェーグレン症候群患者の口唇腺を凍結またはパラフィン包埋し、厚さ6μmの連続切片をクライオスタットまたはミクロトームにて作製した。一次抗体としてシェーグレン患者抗血清からProteinAで精製したIgG抗体を用いた。二次抗体としてHRP標識anti-human IgG biotinylated antibodyを用いて免疫組織化学反応を行った。その結果、シェーグレン症候群患者の腺細胞の核内に陽性所見がみられた。さらに、唾液腺組織または唾液腺培養細胞から蛋白を抽出し、SDS-PAGEで電気泳動した後、イモビロントランスメンブレンに転写後、抗血清、HRP標識二次抗体を用いてECLで抗原を検出した。その結果、複数の蛋白バンドが検出され、SS-AとSS-Bに加え、他の抗核蛋白に対する抗体がシェーグレン患者の血清中に存在することが明らかとなった。今後は、UNIZAP II XRベクターを用いたcDNAライブラリーを作製し、クローニングを行う。