| Budget Amount *help |
¥24,290,000 (Direct Cost: ¥20,600,000、Indirect Cost: ¥3,690,000)
Fiscal Year 2008: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
Fiscal Year 2007: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
Fiscal Year 2006: ¥8,300,000 (Direct Cost: ¥8,300,000)
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| Research Abstract |
背景: 我々は腰椎椎間板ヘルニア患者のDNAサンプルで、大規模な相関解析を行い、CILP遺伝子(cartilage intermediate layer protein)のI395Tにおいて有意な相関を見出した。さらにin vitroの機能解析から、CILP蛋白の高発現が椎間板変性に関わる可能性を見出した(Seki S et al, Nature Genet, 2005)。
研究の目的:CILPトランスジェニックマウス(以下Tg マウス)を作成し、表現型の解析やin vivoにおけるCILPの役割を詳細に検討すること。
方法: CILP Tg マウスの作成の方法は、軟骨特異的発現ベクター pNASS…(COL11A2 promoter、IVS1) を用い、このベクターにCILP遺伝子(C末にHA tagを挿入)を導入しマイクロインジェクションによってTg マウスを作成する。またこのTg マウスを用い、表現型を解析する。
結果: CILP Tg マウスのlineの維持および繁殖
遺伝子導入はPCR、mRNAはreal-time PCR法で確認し、CILP蛋白の発現解析は、HA抗体、N末、C末抗体の3種類使用し、これらでウエスタンブロット、免疫染色でTg マウスにおけるCILP蛋白の発現を確認できた。
CILP Tg マウスの表現型の解析
椎間板の構造(髄核、線維輪)を、組織学的に確認すると、サフラニン-O染色にて髄核組織の染色性が有意にTg マウス群で低下していた。さらに脊椎椎間板をMRIで評価すると、Tg マウスの腰椎MRIT2強調画像において、腰椎椎間板の輝度はノーマルマウスと比べて低下していたことから、明らかな椎間板変性の進行が認められたと考えられる。またTg マウスとノーマルマウスで、腰椎レントゲン上の椎間板高の違いを有意に認めている。
CILP Tg マウスの頚椎椎間板変性、ヘルニアモデルの作成
マウスの頚椎に不安定性を導入すると頚椎椎間板変性、ヘルニアができることがわかっており、このモデルで、変性誘導後の頚椎椎間板をレントゲン、組織学的評価を現在行っている。
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