| Project/Area Number |
18750146
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Chemistry related to living body
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
清中 茂樹 Kyoto University, 工学研究科, 助教 (90422980)
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| Project Period (FY) |
2006 – 2007
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2007)
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| Budget Amount *help |
¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
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| Keywords | TRPチャネル / 拮抗剤 / アフィニティーラベル |
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| Research Abstract |
昨年度に選択的なTRPチャネル拮抗剤が得られたので、アフィニティーラベル化を応用した新しいタンパク質修飾法を用いて拮抗剤の作用部位及び作用機構について検討した。具体的には以下の手順で行った。1)アフィニティーラベル化反応部位及びラベル化修飾が可能な官能基を有するピラゾール誘導体(ラベル化剤)の分子設計および合成 2)培養細胞内にこのラベル化剤を加えて光照射することによるチャネルのアフィニティーラベル化 3)ラベル化剤の修飾部位に標識剤(ビオチン)を選択的に修飾した。その際に用いる反応は、ケトンーヒドロキシアミンという、生体内には存在しない化学反応を用いているので、副反応を起こすことなくラベル化タンパク質だけをビオチン標識できた。4)TRPチャネルの抗体及びビオチンに対する抗体を利用したアフィニティー精製を行うことで、ラベル化されたTRPチャネルを得た。
光アフィニティーラベル化の進行については、ウェスタンブロッティング法を用いて確認を行った。また、透過型電子顕微鏡を用いてチャネルに拮抗剤が直接結合していることも明らかにした。具体的にはラベル化後修飾ステップでビオチン標識を行い、アビジンを使ったアフィニティ精製後に標識タンパクの電子顕微鏡観察(ネガティブ染色)を行うという方法である。その結果を基に、チャネルの阻害機構及び活性化機構まで考察した。
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