細胞周期における新規蛋白質リン酸化酵素NEK11とその複合体の生理機能の解析

• Project/Area Number: 18770123
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: Kyoritsu University of Pharmacy (2007); National Institute of Infectious Diseases (2006)
• Principal Investigator: 野口 耕司 Kyoritsu University of Pharmacy, 薬学部, 准教授 (80291136)
• Project Period (FY): 2006 – 2007
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2007: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2006: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
• Keywords: NIMA / キナーゼ / Nek11 / 細胞周期 / 精製 / シャペロン / アポトーシス / 質量分析

Research Abstract

Nek11は我々が同定してきた分子であり、細胞核小体で機能する新規キナーゼで細胞周期制御に関わることが強く示唆されるが、その生理機能の解析は未だ不十分なままである。本研究課題では、独自に見出してきたNek11の生理機能解明を推進するため、Nek11結合蛋白質の同定を目的とした。そのため、タンデムタグ(FLAGとHAタグ)を融合させたNek11蛋白質を培養細胞に安定発現させ、Nek11複合体の性状を解析することを計画したが、実際にFLAG, HAタグつきのマウスのNek11遺伝子を組み込んだベクターpLXINで作製したマウス組み換えレトロウイルスを作成し、その組換えウイルスを種々のマウス細胞株に感染させてみた結果、Nek11の安定発現細胞株を樹立することは極めて困難であることが判明した。しかし、293細胞を用いた一過性発現ではタグ付きNek11の発現は可能であったため、この一過性発現系によりFLAGタグ付きのNek11蛋白質複合体を精製した。この複合体を電気泳動した場合には、幾つかの蛋白質が共沈してきており、ウエスタンプロット法からHsp70とHsp90の存在が確認された。また、Nek11複合体を質量分析器にかけて調べたところ、ANT2もNek11と複合体を形成していることが判明した。Hsp70とHsp90は蛋白質の折りたたみに関わるシャペロンであり、一般にキナーゼはシャペロンにより構造が安定化されている事が知られているので、Nek11もシャペロンが必要と推測された。ANT2はadeninen ucleotide輸送蛋白質であり、Nek11にどのような作用しているのか今後検討していきたい。
また、Nek11の導入発現が導入細胞に対してなんらかの悪影響、細胞毒性を与えていることが示唆されたが、種々のNek11遺伝子変異体を作成し.Nek11蛋白質のどの領域が細胞毒性をもたらすのかを詳細に検討したところ、非触媒部位の特定の領域、コイルドコイルドメインが細胞毒性、アポトーシスを強く誘発するという結果が得られた。Nek11の生理機能との関係を含めて詳細を解析していく予定である。