| Project/Area Number |
18779004
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Functional biochemistry
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| Research Institution | Kyoto University (2007)
Kobe University (2006) |
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Principal Investigator |
土居 雅夫 Kyoto University, 薬学研究科, 講師 (20432578)
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| Project Period (FY) |
2006 – 2007
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2007)
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| Budget Amount *help |
¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
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| Keywords | 生体リズム / 遺伝子転写 / PERIOD2 / 視交叉上核 / PER10D2 / 視交叉上枝 / GPCR |
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| Research Abstract |
交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。生体リズムの形成維持を担う時計センターは、脳内視床下部に存在する視交叉上核(SCN)にある。SCNに発現する遺伝子群を網羅的に捕らえるため、高純度のSCN抽出RNA溶液を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。ここで得られた候補分子群の発現を確定する目的で、SCN組織切片を用いてさらにin situ hybridizationを行った。また、転写リズムの生成に関わる核内機能複合体の同定を目指し、時計発振ループの中枢因子PER2に結合する蛋白質(PER-binding protein,ここではPAPと呼ぶ)を検索した。PER2-PAP複合体を精製するため、Flagタグ付きのPER2蛋白質を発現する細胞株を作出した。PER2蛋白質が転写抑制因子として機能する特定の時間帯(血清刺激後8-14時間後)を狙って細胞を回収し、核抽出液に含まれるmPER2蛋白質複合体を抗Flag抗体カラムを用いてアフィニティー精製した。この複合体をグリセロールグラジエント法を用いてサイズ分画した後、アクリルアミドゲルに展開した。銀染色によって検出したタンパク質を質量分析解析に供し、PAPの候補となる新規分子を同定することに成功した。この分子の特性を知るため、組み換え蛋白質を調製し、これを抗原として使用することによりPAPを特異的に認識するための抗体を得た。
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