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アミロプラストの分化・糖代謝の機序解明を目指したデンプン生合成制御因子の同定

Research Project

Project/Area Number 18780067
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Applied biochemistry
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

濱田 茂樹  Hokkaido University, 大学院・農学研究院, 助教 (90418608)

Project Period (FY) 2006 – 2007
Project Status Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help
¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000)
Fiscal Year 2007: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2006: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywordsイネ培養細胞 / デンプン生合成 / スクロース誘導 / プロテオーム / リン酸化タンパク質
Research Abstract

本研究では,タンパク質のリン酸化による種子貯蔵物質蓄積の制御に着目し、イネ登熟種子におけるリン酸化タンパク質の網羅的解析および、そのタンパク質の機能解析を目的とした。
イネ登熟種子より得られた粗抽出液を陰イオン交換および疎水クロマトグラフィーにより部分精製を行なった。得られた溶出画分を一次元および二次元電気泳動に供し、泳動後のゲルをPro-Q Diamond Gelstainを用いて染色することで、リン酸化タンパク質を検出した。得られたタンパク質バンド(スポット)は、トリプシンによるゲル内消化後、MALDI/TOF-MS解析により同定された。その結果、nucleoside diphosphate kinase 1やRNA binding protein 120、Heat shock protein 82(Hsp82)など7種類のリン酸化タンパク質が同定され、これらのタンパク質がリン酸化により機能制御を受けていることが示唆された。
同定されたリン酸化タンパク質の中から、登熟種子におけるタンパク質の存在量やリン酸化度の高さから、特にHsp82に注目した。Hsp82はレトロトランスポゾンによる遺伝子破壊株が存在し、その種子は低稔性を示すことが知られており、種子形成に重要なタンパク質であると予想された。Hsp82をコードするcDNAは、登熟種子から抽出したmRNAの逆転写産物を鋳型としたPCRにより単離した。Hsp82のアミノ酸配列に基づいたドメイン検索からN末側にはATP加水分解に必要なH^+ATPase領域、C末側にはシグナル伝達タンパク質の機能と安定性を調節する分子シャペロンHsp90領域が確認された。また、同定したHsp82とGFPの融合タンパク質を35Sプロモーターで発現するバイナリーベクターを作成し、パーティクルボンバードメント法によりタマネギ表皮細胞内に導入し、細胞内局在を観察した。
その結果、細胞質で強い蛍光が観察されたことから、本Hsp82は細胞質において機能していることが示唆された。RT-PCRを用いた発現特性の解析から、本遺伝子が種子のみならず、葉やカルスにおいても発現することが確認された。現在、アンチセンス体の作製やリン酸化部位の同定を試みている。

Report

(2 results)
  • 2007 Annual Research Report
  • 2006 Annual Research Report
  • Research Products

    (12 results)

All 2007 2006

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (6 results)

  • [Journal Article] The N-terminal region of the starch-branching enzyme from Phaseolus vulgaris L. is essential for optimal catalysis and structural stability.2007

    • Author(s)
      Shigeki Hamada, et. al.
    • Journal Title

      Phytochemistry 68

      Pages: 1367-1375

    • NAID

      120000967623

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Differential chain-length specificities of two isoamylase-type starch-debranching enzyme from developing seeds of kidney bean.2007

    • Author(s)
      Yoshinori Takashima, et. al.
    • Journal Title

      Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9)

      Pages: 2308-2312

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Enzymatic characterization of starch synthase III from kidney bean (Phaseolus vulgaris L.)2007

    • Author(s)
      Takeshi Senoura, et. al.
    • Journal Title

      FEBS Journal 274

      Pages: 4550-4560

    • Related Report
      2007 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Catalytic implications of the higher plant ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit.2007

    • Author(s)
      Seon-Kap Hwang et al.
    • Journal Title

      Phytochemistry 68

      Pages: 464-477

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] The N-terminal region of the starch-branching enzyme from Phaseolus vulgaris L. is essential for optimal catalysis and structural stability.2007

    • Author(s)
      Shigeki Hamada et al.
    • Journal Title

      Phytochemistry (In Press)

    • NAID

      120000967623

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Journal Article] ATP binding site in the plant ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit.2006

    • Author(s)
      Seon-Kap Hwang et al.
    • Journal Title

      FEBS Letters 580

      Pages: 6741-6748

    • Related Report
      2006 Annual Research Report
  • [Presentation] イネADP-glucose pyrophosphorylaseアイソザイムの発現特性と酵素特性2007

    • Author(s)
      西村祐美
    • Organizer
      日本農芸化学会北海道支部2007年度秋季学術講演会
    • Place of Presentation
      網走 (東京農業大学)
    • Year and Date
      2007-11-11
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] ジャガイモ塊茎ADP-glucose pyrophosphorylase 調節サブユニットへのATP結合が酵素活性に与える影響2007

    • Author(s)
      和久田真司
    • Organizer
      日本農芸化学会北海道支部2007年度秋季学術講演会
    • Place of Presentation
      網走 (東京農業大学)
    • Year and Date
      2007-11-11
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] インゲンマメ登熟種子由来イソアミラーゼアイソザイムの酵素特性2007

    • Author(s)
      瀬野浦武志
    • Organizer
      日本農芸化学会北海道支部2007年度秋季学術講演会
    • Place of Presentation
      網走 (東京農業大学)
    • Year and Date
      2007-11-11
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] インゲンマメ登熟種子由来プロテインキナーゼのクローニングおよび発現特性2007

    • Author(s)
      清木慈子
    • Organizer
      日本農芸化学会北海道支部2007年度秋季学術講演会
    • Place of Presentation
      網走 (東京農業大学)
    • Year and Date
      2007-11-11
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] 植物ADP-glucose pyrophosphorylase調節サブユニットヘのATPの結合2007

    • Author(s)
      和久田真司
    • Organizer
      日本応用糖質学会 平成19年度大会
    • Place of Presentation
      藤沢(日本大学)
    • Year and Date
      2007-08-29
    • Related Report
      2007 Annual Research Report
  • [Presentation] イネ培養細胞におけるスクロース誘導タンパク質の同定および発現解析2007

    • Author(s)
      濱田茂樹
    • Organizer
      日本応用糖質学会 平成19年度大会
    • Place of Presentation
      藤沢 (日本大学)
    • Year and Date
      2007-08-29
    • Related Report
      2007 Annual Research Report

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Published: 2006-04-01   Modified: 2016-04-21  

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