SHRにおけるインスリン抵抗性遺伝子KAT-1の過剰発現及び欠損マウスによる解析

• Project/Area Number: 18790612
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Metabolomics
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 飯塚 陽子 The University of Tokyo, 医学部附属病院, 特任研究員 (40420244)
• Project Period (FY): 2006 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2007)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2007: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2006: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: インスリン抵抗性 / 遺伝子導入 / SHR(高血圧自然発症ラット) / 高血圧 / 交感神経活動亢 / 延髄吻側腹外側野(RVLM) / telemetryシステム / インスリン感受性 / 交感神経活動亢進

Research Abstract

【目的】メタボリックシンドロームのモデル動物である高血圧自然発症ラット(SHR)の3番染色体には血圧と体重、脂肪細胞でのインスリン抵抗性と脂肪分解障害に連鎖するQTL(quantitative trait locus)が集簇し、われわれはその原因候補遺伝子としてKAT-1(kynurenine aminotransferase-1遺伝子)を同定し、SHRのKAT-1には機能的変異(E61G)が存在することを報告してきた。本研究では、ジーンターゲティング法を用いてKAT-1ノックアウトマウスの作製を目指し、その解析を通じて、SHRにおけるインスリン抵抗性原因候補遺伝子としてのKAT-1の果たす役割を明らかにすることが目的である。
【方法】ES細胞を用いたジーンターゲティングの常法に従い実験を行った。マウスのKAT-1遺伝子全長を含むP1ファージクローンを単離し、そのゲノム遺伝子の構造解析を行った。マウスKAT-1遺伝子は13個のエクソンよりなり、エクソン5-7に活性に重要なドメインが集中しているため、この領域の欠失を狙ったターゲティングベクター構築を進めた。また、SHRにおいてE61Gミスセンス変異がヤウスのエクソン2に存在しているため、翻訳開始点、E61Gも含めた領域の欠損を狙ったターゲティングベクターの構築も行った。ES細胞へのインジェクション、マウス間での交配実験を通じてKAT-1遺伝子欠損マウスを作製した。【成績】1)制限酵素を用いた遺伝子組み換えによりターゲティングベクターを構築し、DNAシークエンシングにより塩基配列を確認した。2)エレクトロポレーション法により、ターゲティングベクターをES細胞に導入し、PCR法及びSouthern blot解析により、全部で25個の陽性クローンが確認された。3)過排卵による採卵、ES細胞へのマイクロインジェクション、子宮内への移植等によりキメラマウスが得ら、現在さらなる交配を通じて、F1マウスの作出を試みている。
【結論】ジーンターゲティング法を用いて、KAT-1のキメラマウスが得られた。今後マウス間での交配によりKAT-1のホモ・ヘテロのノックアウトマウスを作製し、高血圧をはじめとするSHRのメタボリックシンドローム様表現型とKAT-1との関連性をin vivoで明らかにする。