レーザーキャプチャー・ダイセクションを用いた内耳感覚細胞のアールエヌエー解析

Research Project

Project/Area Number	18791194
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Otorhinolaryngology
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	古宇田寛子医科歯科大, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80334423)
Project Period (FY)	2006 – 2008
Project Status	Completed (Fiscal Year 2008)
Budget Amount *help	¥3,340,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2008: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2007: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2006: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Keywords	ヒト側頭骨 / 難聴遺伝子解析 / RNA / TagMan PCR / 凍結標本 / TaqMan PCR
Research Abstract	内耳は感覚細胞である有毛細胞、エネルギー産生を担う血管条、ラセン神経節などを含み、高度に分化した細胞の集合体である。難聴の病態を分子学的に解明するために、個々の細胞からDNA,RNAを抽出・解析することを目的としている。すでにホルマリン固定セロイジン包埋ヒト側頭骨標本からは、レーザーキャプチャーマイクロダイゼクションを用いてヒト内耳を構成する細胞を分別採取し、抽出したDNAをTaqMan PCRで解析することで、細胞レベルにおけるDNA解析の手法を取得している。より不安定なRNAに関しては、昨年の報告で、ヒト凍結標本から膜迷路を採取してそこからRNAを抽出し、TaqMan PCRを用いて組織レベルでの解析を行なう手法を開発した。さらにヒト内耳凍結標本を用いて細胞レベルでの解析を行なうために、レーザーキャプチャーマイクロダイゼクションとTaqMan PCRを組み合わせて解析する手法を安定させるべく、再度ホルマリン固定セロイジン包埋ヒト側頭骨標本を用いて手技の安定性の検討を行なった。対象はMELAS症例2例の側頭骨標本とした。MELASはミトコンドリア病の1型で難聴を高率に合併するが、その臨床症状、難聴の程度は症例により異なる。側頭骨病理所見では、血管条とラセン神経節の変性が主な所見と考えられ、1例については先の検討で、病理組織学的所見と細胞レベルでのDNAの変異度が比較的一致するとの結果を得た。さらに1例のホルマリン固定セロイジン包埋標本について、細胞レベルでのDNA変異率の解析を行なっている。