初代網膜色素上皮培養細胞における形質転換および移植手術に関する研究

Research Project

Project/Area Number	18791286
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Ophthalmology
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	川路隆博 Kumamoto University, 医学部附属病院, 助教 (30423677)
Project Period (FY)	2006 – 2007
Project Status	Completed (Fiscal Year 2007)
Budget Amount *help	¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000) Fiscal Year 2007: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2006: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Keywords	網膜色素上皮 / 移植 / 再生医療 / 外科 / 形質転換 / 移植・再生医療
Research Abstract	初代網膜色素上皮細胞の単離および培養技術の確立生後1-2週間のラット眼を速やかに摘出して、角膜、虹彩、水晶体を除去し、後部眼のみをコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼに約60分、さらにトリプシンによる酵素処理を約60分行う。適宜、使用培地内でさらに約1〜2時間培養し、網膜色素上皮細胞をシート状に単離し、数分トリプシン処理を行った後に、プラスチックの培養プレート上で培養していった。コンフルエントなシート培養条件において、網膜色素上皮細胞が生理的な状態にどれだけ近づいているかは以下の方法で検討した。免疫組織染色実験において、細胞間結合装置であるZO-1や特異的細胞タイプマーカーとみなされるサイトケラチンの発現を確認した。また、RT-PCRにより、RPE-65(網膜色素上皮細胞に特異的なmRNA)の発現を確認した。以上の確認と共に、形態上の違いをセルラインと比較すると、ARPE-19などのセルラインでは、6角形の形態を持つ網膜色素上皮像はまず得られず、線維芽細胞様の形態を示し、色素沈着も認められない。一方、今回の検討では、生理的な網膜色素上皮の形態である6角形を示すとともに、数週間培養していくうちに、色素沈着も認め、極めて生理的な条件に近い初代網膜色素上皮細胞の単離技術を得ることが出来た。眼底周辺部の比較的視機能に問題のない領域より網膜色素上皮を採取し、黄斑部へ移植するための技術を確立するため、有色ウサギ眼を用いて、ブルッフ膜と脈絡膜まで含めた網膜色素上皮のブロック切除と、網膜色素上皮のみを擦過して採取する方法を試みたが、ブロック切除の方が、効率的な方法であった。現在自家網膜色素上皮を他部位に移植し、術後経過についての評価を行っている。周辺部網膜色素上皮採取技術の確立