Proteomic analysis of cancer biology for EMT in 3D cell culture system

• Project/Area Number: 18F18414
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 外国
• Review Section: Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 梁 明秀 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (20363814)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SHIN JIHYE 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2018-10-12 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2020: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2019: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2018: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
• Keywords: proteome / mass spectrometry / BONCAT / secretome / EMT / 3D-culture / TGF-b

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではAHA標識新規合成タンパク質を簡便かつ網羅的に解析できる技術を開発し、3D培養肺癌細胞でTGFβ誘導性EMTに関連して発現変動するタンパク質を探索し、微小環境下でのEMT誘導メカニズムの解明を目指している。そのために、今年度は以下の研究を実施した。
1.これまで開発したBONCAT/in-stage tip及びBONCAT/click-beads法の問題点であった、AHA標識ペプチドの濃縮効率を改善する目的で、AHAを捕捉するための新たな化合物を合成した。新規化合物を用いることで、以前の方法よりも非特異的結合ペプチド量が大幅に減少し、AHA標識ペプチドの濃縮効率が改善した。その結果、AHA修飾ペプチドの同定数が増え、少量の試料からAHA標識新規合成タンパク質を網羅的に解析することが可能となった。また本研究において開発したAHA修飾ペプチドを濃縮するための化合物について、企業と共同で特許を出願した。さらに、これらの結果をまとめて国際学術誌に論文を投稿する準備を進めている。
2. 2Dと3D培養肺癌細胞をTGFβにて刺激した場合の細胞内プロテオームとリン酸化プロテオームを解析し、2倍以上発現変動(p<0.05)するタンパク質を抽出した。その結果に基づき、パスウェイ解析ソフトウェアIPAを用いて、関連する上流因子や下流の生化学的機能を予測した。上流因子については、TGFβを含めて大きな違いは検出されなかったが、下流の生化学的機能については、細胞の運動性の高まりや細胞死が抑制され生存力が向上する傾向などが、2Dよりも3D培養細胞において確認された。今後は、これまでの結果の検証を行うと共に、TGFβ刺激後の新規合成プロテオーム解析などを行い、統合的な解析を実施する予定である。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Mutation-specific non-canonical pathway of PTEN as a distinct therapeutic target for glioblastoma (2021)
  • Author(s): Seung Won Choi, Yeri Lee, Kayoung Shin, Harim Koo, Donggeon Kim, Jason K Sa, Hee Jin Cho, Hye-Mi Shin, Se Jeong Lee, Hyunho Kim, Seok Chung, Jihye Shin, Cheolju Lee, Do-Hyun Nam
  • Journal Title: Cell Death & Disease Volume: 12(4) Issue: 4 Pages: 374-374
  • DOI: 10.1038/s41419-021-03657-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Secretome analysis of patient-derived GBM tumorspheres identifies midkine as a potent therapeutic target (2020)
  • Author(s): Han Suji、Shin Hyemi、Lee Jin-Ku、Liu Zhaoqi、Rabadan Raul、Lee Jeongwu、Shin Jihye、Lee Cheolju、Yang Heekyoung、Kim Donggeon、Kim Sung Heon、Kim Jooyeon、Oh Jeong-Woo、Kong Doo-Sik、Lee Jung-Il、Seol Ho Jun、Choi Jung Won、Kang Hyun Ju、Nam Do-Hyun
  • Journal Title: Experimental & Molecular Medicine Volume: 52(11) Issue: 11 Pages: 1869-1869
  • DOI: 10.1038/s12276-020-00517-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Common Repository of FBS Proteins (cRFP) To Be Added to a Search Database for Mass Spectrometric Analysis of Cell Secretome (2019)
  • Author(s): Jihye Shin*, Yumi Kwon*, Seonjeong Lee*, Seungjin Na*, Eun Young Hong, Shinyeong Ju, Hyun-Gyo Jung, Prashant Kaushal, Sungho Shin, Ji Hyun Back, Seon Young Choi, Eun Hee Kim, Su Jin Lee, Yae Eun Park, Hee-Sung Ahn, Younghee Ahn, Mohammad Humayun Kabir, Seong-Jun Park, Won Suk Yang, et.al.
  • Journal Title: Journal of Proteome Research Volume: 18(10) Issue: 10 Pages: 3800-3806
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00475
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparative analysis of differentially secreted proteins in serum-free and serum-containing media by using BONCAT and pulsed SILAC. (2019)
  • Author(s): Jihye Shin, Jiheon Rhim, Yumi Kwon, Sun Young Choi, Sungho Shin, Chul-Won Ha, Cheolju Lee.
  • Journal Title: Scientific reports. Volume: 9(1) Issue: 1 Pages: 3096-3096
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39650-z
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 血液成分含有培地を使用したセクレトーム解析技術の開発と今後の展望 (2020)
  • Author(s): Shin Jihye, 小橋 達弘, 梁 明秀, Cheolju Lee, 木村 弥生
  • Organizer: 第71回日本電気泳動学会総会
• [Presentation] Analysis of secretome in serum-containing medium by BONCAT (2019)
  • Author(s): Jihy Shin, Yayoi Kimura, Hisashi Hirano, Cheolju Lee and Akihide Ryo
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2019年大会 第70回日本電気泳動学会総会
• [Patent(Industrial Property Rights)] シクロオクチン誘導体またはその塩、これを用いた標的分子の濃縮方法および検出方法、ならびに濃縮または検出キット (2020)
  • Inventor(s): 堀内 弥生、シン チエ、梁 明秀、小橋 達弘
  • Industrial Property Rights Holder: 公立大学法人横浜市立大学、株式会社ナード研究所
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020