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Physiological functions and selective substrate-cleavage mechanism of E. coli intramembrane protease RseP

Research Project

Project/Area Number 18H02404
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

秋山 芳展  京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (10192460)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 檜作 洋平  京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (70568930)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2020: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2019: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2018: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
Keywords膜内部でのタンパク質切断 / 蛍光ペプチド / 膜内切断プロテアーゼ / 速度論的解析 / 小分子膜タンパク質 / small membrane protein / FRET / 生体膜 / プロテアーゼ / 膜内切断 / 蛍光基質
Outline of Annual Research Achievements

「膜内部でのタンパク質切断」は、原核生物から真核生物まで、様々な生体プロセスで重要な役割を果たす。本研究は、大腸菌のS2Pファミリー膜内切断protease RsePが如何に働き、細胞機能の維持・調節に如何なる役割を持つかを理解し、その制御を目指すものである。本研究では、 (1) RsePの新たな基質を同定し、その切断が細胞機能調整に果たす役割を解明する、(2) in vitro 解析によりRsePの特異的基質認識・相互作用の分子的基盤を解明し、阻害剤を同定する、(3) RsePとの相互作用に伴う基質の構造変化を実証し、その様態を解明することをめざすことを目的としている。
本年度はPAタグを付加したRsePの精製法を構築して精製標品を得、RseAなど既存基質タンパク質を用いて、この精製標品が高い基質切断活性を持つことを示した。また、RsePによる切断を受ける小分子膜タンパク質(small membrane protein: SMP)の候補のスクリーニングをさらに進め、新たな基質候補となる分子を複数見出した。これらについては解析を進めつつある。さらに、RseP酵素活性の詳細な解析を行うために、RseAタンパク質(基質)の膜貫通配列を元にした蛍光標識モデル基質を複数合成した。これらは標識した2種類の蛍光基間のFRETを指標として、切断を定量的にアッセイできるものと期待された。これらモデル基質のRsePによる切断を検討し、少なくともその一つでは、効率よく切断が起こり、RseP依存的な切断をリアルタイムで追跡できることが分かった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

高活性RsePの精製に成功し、合成した蛍光ペプチド基質と組み合わせてin vitroでRseP酵素活性を解析できることを予備的に示した。さらに、新たな基質候補SMPも見言いだして解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

SMPに関しては、さらにスクリーングを進めて新たな基質候補の同定を目指すと共に、その切断をin vivo/in vitroで解析する。RsePはさらに高活性・高純度の標品を得るべく精製法を改良する。蛍光ペプチドを用いて効率の良いin vitro切断条件を見出し、詳細なRseP活性の解析を目指す。

Report

(1 results)
  • 2018 Annual Research Report

Research Products

(8 results)

All 2019 2018

All Journal Article Presentation

  • [Journal Article] Heat shock transcription factor σ<sup>32</sup> defective in membrane transport can be suppressed by transposon insertion into genes encoding a restriction enzyme subunit or a putative autotransporter in <i>Escherichia coli</i>2019

    • Author(s)
      Yura Takashi、Miyazaki Ryoji、Fujiwara Keigo、Ito Koreaki、Chiba Shinobu、Mori Hiroyuki、Akiyama Yoshinori
    • Journal Title

      Genes & Genetic Systems

      Volume: 93 Issue: 6 Pages: 229-235

    • DOI

      10.1266/ggs.18-00040

    • NAID

      130007528427

    • ISSN
      1341-7568, 1880-5779
    • Year and Date
      2019-01-19
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structural Basis for the Function of the β-Barrel Assembly-Enhancing Protease BepA2019

    • Author(s)
      Mohammad Shahrizal, Yasushi Daimon, Yoshiki Tanaka, Yugo Hayashi, Shintaro Nakayama, Shigehiro Iwaki, Shin-ichiro Narita, Hironari Kamikubo, Yoshinori Akiyama, Tomoya Tsukazaki
    • Journal Title

      Journal of Molecular Biology

      Volume: 431 Pages: 625-635

    • DOI

      10.1016/j.jmb.2018.11.024

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Identification of an internal cavity in the PhoQ sensor domain for PhoQ activity and SafA-mediated control2019

    • Author(s)
      K. Yoshitani, E. Ishii, K. Taniguchi, H. Sugimoto, Y. Shiro, H. Mori, Y. Akiyama, A. Kato, R. Utsumi, Y. Eguchi
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 83 Pages: 1-11

    • DOI

      10.1080/09168451.2018.1562879

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Identification and characterization of a translation arrest motif in VemP by systematic mutational analysis2018

    • Author(s)
      Mori, H., Sakashita, S., Ito, J., Ishii, E. and Akiyama, Y.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 293 Pages: 2915-2926

    • DOI

      10.1074/jbc.m117.816561

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A photo-cross-linking approach to monitor folding and assembly of newly synthesized proteins in a living cell2018

    • Author(s)
      Miyazaki, R., Myogo, N., Mori, H. and Akiyama, Y.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 293 Pages: 677-686

    • DOI

      10.1074/jbc.m117.817270

    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePの新規機能調節領域の解析2018

    • Author(s)
      三宅拓也、檜作洋平、秋山芳展
    • Organizer
      第15回21世紀大腸菌研究会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
  • [Presentation] Functional and structural roles of a membrane-periplasm interface domain in RseP, an Escherichia coli S2P family intramembrane protease.2018

    • Author(s)
      Miyake, T., Hizukuri, Y. and Akiyama, Y.
    • Organizer
      International symposium Proteins: From the Cradle to the Grave
    • Related Report
      2018 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePの構造維持と機能調節に関わる新規ドメインの解析2018

    • Author(s)
      三宅拓也、檜作洋平、秋山芳展
    • Organizer
      第91回日本生化学会大会
    • Related Report
      2018 Annual Research Report

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Published: 2018-04-23   Modified: 2020-08-26  

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