抗老化因子Δ133p53による軟骨細胞への分化誘導と増殖の分子機構解明とその応用

Research Project

Project/Area Number	18H02925
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 56020:Orthopedics-related
Research Institution	Akita University (2021) Kyoto University (2018-2020)
Principal Investigator	藤田香里秋田大学, 理工学研究科, 講師 (10633092)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000) Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000) Fiscal Year 2020: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2019: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2018: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Keywords	細胞老化 / p53 / p53 isoforms / 間葉系幹細胞 / 軟骨細胞 / 老化 / シグナル伝達 / delta133p53 / 分化誘導 / 増殖 / p53 isoform / 抗老化 / Δ133p53 / 軟骨細胞への分化誘導 / 軟骨細胞増殖
Outline of Annual Research Achievements	研究の全体構想はΔ133p53を用いて高齢患者の老化間葉系幹細胞から効率よく移植用軟骨細胞を得る方法と老化軟骨細胞増殖促進の方法確立のための分子機構を解明し実際の培養方法確立へ繋げることである。具体的には①抗老化因子Δ133p53がどのように老化を制御して軟骨細胞に分化誘導するかについてΔ133p53過剰発現老化間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化誘導後、及び②老化軟骨細胞をどのように若返らせ増殖促進させるかについてΔ133p53過剰発現老化軟骨細胞を使用しRNAシーケンスとクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-Seq)を行い明らかにする、③内在性Δ133p53や見出された分子を増加させる低分子化合物をスクリーニングするための細胞評価系をゲノム編集技術による内在性タンパク質の可視化で構築する、の３つを行う。継代培養を繰り返して細胞老化した（=senescent)ヒト間葉系幹細胞にdelta133p53を過剰発現させ、ベクターコントロール細胞（=senescent）を実験回毎に作製し、ベクターコントロール細胞とdelta133p53過剰発現細胞を軟骨細胞に分化誘導し、継時的（０、７、１４、２１、２８日）にサンプリングした。それらを使い、RNA-seqにより変動遺伝子の解析を行った。現在、データの詳細な解析を行なっている。また、同時にサンプリングしたものをChIP-Seq解析するため、ChIPの条件検討を行っている。また臨床応用を踏まえ、delta133p53の遺伝子を導入せずに老化間葉系幹細胞から効率よく軟骨細胞を分化誘導させるため、ドラッグスクリーニングを検討している。その細胞評価系の構築の条件検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 分化誘導した軟骨細胞パーティクルを使用したクロマチン免疫沈降シーケンスのサンプル調整の条件検討に時間がかかってるため。また、間葉系幹細胞を老化させるのための培養が２～３ヶ月かかり、そこから実験が開始されるため。
Strategy for Future Research Activity	軟骨細胞パーティクルを使用したクロマチン免疫沈降シーケンスのサンプル調整条件を早急に決定後、遂行する。得られた結果からdelta133p53の軟骨細胞分化におけるターゲット遺伝子候補をピックアップする。さらにターゲット候補遺伝子とRNA-seqの結果をもとに、間葉系幹細胞の老化、軟骨細胞への分化の役割を解析していく。さらに、細胞若返りの指標となるdelta133p53の発現誘導可能なドラッグスクリーニングに向けた細胞評価系の構築を行って行く。まずは、作製したベクターを導入する方法を完成させる。