ヒトiPS細胞由来ネフロン誘導法に基づく腎細胞癌多段階発がん機構と治療開発基盤

• Project/Area Number: 18H02938
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56030:Urology-related
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 馬場 理也 熊本大学, 国際先端医学研究機構, 准教授 (10347304)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神波 大己 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (20402836) ; 平山 明由 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科(藤沢), 特任講師 (00572405) ; 長嶋 洋治 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (10217995) ; 古屋 充子 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (10361445) ; 矢尾 正祐 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (00260787) ; 岡田 誠治 熊本大学, エイズ学研究センター, 教授 (50282455)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000); Fiscal Year 2019: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2018: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 腎細胞癌 / ヒトiPS細胞 / オルガノイド / 多段階発癌 / 癌抑制遺伝子 / ドライバー遺伝子 / ドライバー遺伝子変異 / 腎オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

近年の大規模遺伝子変異解析から、ヒト腎細胞癌(RCC)において基本となる癌抑制遺伝子の欠損に加えて、高頻度に見られるドライバー遺伝子変異が明らかにされてきた。しかし、これらのゲノム変異が実際にRCCを引き起こす事を、ヒトの系で検証して発がん機構に迫ることは不可能である。そこで本研究では、ゲノム変異導入ヒトiPS細胞からインビトロでヒトネフロン（腎オルガノイド）を誘導し、さらにヒトRCCの段階的な発がん過程を再現することで、その多段階発癌の分子機構を解明する事を目指し、研究を推進している。
平成30年度は、非淡明細胞型腎細胞癌(nonccRCC)のがん抑制遺伝子の一つであるFLCN遺伝子を欠損したヒトiPS細胞株を、CRISPR/Cas9システムにより複数株樹立するとともに、ネフロン前駆細胞への分化能の評価、さらには腎オルガノイドへの誘導を行った。並行してFLCN遺伝子がネフロン前駆細胞自体の発生や分化能に関与する可能性を検証する為、ネフロン前駆細胞特異的にFlcnを欠損した遺伝子改変マウスを作製し解析を進めている。また、淡明細胞型腎細胞癌(ccRCC)のがん抑制遺伝子であるVHL欠損ヒトiPS細胞株作製の為のターゲティングベクターを作製し、HEK293 細胞を用いてCRISPR/Cas9システムによるノックアウトの条件検討を完了した。実際のヒトccRCCにおいては、VHL遺伝子変異に加えて対側アリルの染色体3番短腕欠損が極めて高頻度に認められる。さらにccRCCの主たる3つのドライバー遺伝子(PBRM1, BAP1, SETD2)がこの染色体3番短腕に位置していることから、染色体3番短腕欠損を人為的に導入する為の条件検討をHEK293細胞を用いて行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、癌抑制遺伝子FLCNノックアウトiPS細胞株を複数株樹立し、ネフロン前駆細胞へと分化させ、さらに腎オルガノイドを作製し解析中である。また、FLCNの欠損自体がネフロン前駆細胞への分化やその機能に影響を与える可能性を検討する為に、遺伝子改変マウスを作製しネフロン前駆細胞におけるFlcnの役割の解析を進めた。ccRCCにおいては、染色体3番短腕欠損によりVHLの完全欠損に加えて起こる3つのドライバー遺伝子の複合的な欠損の意義を検討する事が重要と考え、当初の予定にはなかった人為的に染色体3番短腕欠損を導入する為の条件検討を行い、ある程度の目処が立った。また、CRISPR/Cas9システムによりドライバー遺伝子に効率良く変異を導入する為の条件検討が完了しており、次年度への展開が期待される。

Strategy for Future Research Activity

FLCN欠損ヒトiPS細胞株の腎オルガノイドへの分化誘導実験を継続し、その特性評価を行う。加えて、FLCN欠損ヒトiPS細胞株にドライバー遺伝子変異を導入した細胞株を樹立し、さらに腎オルガノイドへと分化させ、その表現型を詳細に解析する。並行して、平成30年度に確立した染色体3番短腕欠損の人為的導入方法を用いて、片側アリルのみに染色体3番短腕欠損をもつヒトiPS細胞株を樹立する。引き続き対側アリルのVHL遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりノックアウトしたヒトiPS細胞株を樹立するとともに、ドライバー遺伝子変異を追加で導入した細胞株の樹立を進める。変異導入iPS細胞株は樹立した時点でネフロン前駆細胞への分化効率等の特性評価をおこなう。また、腎オルガノイドから癌細胞が発生するまでにある程度の時間を要する可能性を踏まえ、腎オルガノイドの長期培養法の検討を並行して進める。導入するゲノム変異が、iPS細胞のネフロン前駆細胞への分化能や腎オルガノイドへの分化能に悪影響を及ぼす可能性も考えられる。そこでバックアップとして、ヒト近位尿細管由来細胞株HK2へのCRISPR/Cas9システムによるゲノム変異の導入も、並行して進めていく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] National Cancer Institute, NIH(米国)
• [Int'l Joint Research] Cancer Science Institute of Singapore(シンガポール)
• [Journal Article] TFE3 Xp11.2 translocation renal cell carcinoma mouse model reveals novel therapeutic targets and identifies GPNMB as a diagnostic marker for human disease. (2019)
  • Author(s): Baba M, Furuya M, Motoshima T, Lang M, Funasaki S, Ma W, Sun HW, Hasumi H, Huang Y, Kato I, Kadomatsu T, Satou Y, Morris N, Karim BO, Ileva L, Kalen JD, Wilan Krisna LA, Hasumi Y, Sugiyama A, Kurahashi R, Nishimoto K, Oyama M, Nagashima Y, Kuroda N, Araki K, Eto M, Yao M, Kamba T, Suda T, Oike Y, Schmidt LS, Linehan WM
  • Journal Title: Molecular Cancer Research Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1158/1541-7786.mcr-18-1235
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] MiR-204-5p: a novel candidate urinary biomarker of Xp11.2 translocation renal cell carcinoma. (2019)
  • Author(s): Kurahashi R, Kadomatsu T, Baba M, Hara C, Itoh H, Miyata K, Endo M, Morinaga J, Terada K, Araki K, Eto M, Schmidt LS, Kamba T, Linehan WM, Oike Y.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1111/cas.14026
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RBM10-TFE3 Renal Cell Carcinoma Characterized by Paracentric Inversion with Consistent Closely Split Signals in Break-apart Fluorescence in situ Hybridization : Study of Ten Cases and a Literature Review (2019)
  • Author(s): Ikuma Kato, Mitsuko Furuya, Masaya Baba, Yoichi Kameda, Masanori Yasuda, Koshiro Nishimoto, Masafumi Oyama, Toshinari Yamasaki, Osamu Ogawa, Hitoshi Niino, Noboru Nakaigawa, Yuta Yano, Kazumasa Sakamoto, Yoji Urata, Kazuya Mikami, Shigetaka Yamasaki, Reiko Tanaka, Toshio Takagi, Tsunenori Kondo, Yoji Nagashima
  • Journal Title: Histopathology Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1111/his.13866
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Editorial Comment to Annexin A1 expression is correlated with malignant potential of renal cell carcinoma. (2019)
  • Author(s): Baba M.
  • Journal Title: International Journal of Urology Volume: 26 Pages: 291-291
  • DOI: 10.1111/iju.13899
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Folliculin Regulates Osteoclastogenesis Through Metabolic Regulation (2018)
  • Author(s): Masaya Baba, Mitsuhiro Endoh. Wenjuan Ma, Hirofumi Toyama. Akiyoshi Hirayama, Keiyo Takubo, Hiroyuki Hano. Hisashi Hasumi, Terumasa Umemoto, Michihiro Hashimoto, Nobuko Irie, Chiharu Esumi, Miho Kataoka, Naomi Nakagata, Tomoyoshi Soga, Masahiro Yao, Tomomi Kamba, Takashi Minami, Masaru Ishii, Toshio Suda
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Research Volume: 33 Issue: 10 Pages: 1785-1798
  • DOI: 10.1002/jbmr.3477
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] BHD-associated kidney cancer exhibits unique molecular characteristics and a wide variety of variants in chromatin remodeling genes (2018)
  • Author(s): Hisashi Hasumi, Mitsuko Furuya, Kenji Tatsuno, Shogo Yamamoto, Masaya Baba, Yukiko Hasumi, Yasuhiro Isono, Kae Suzuki, Ryosuke Jikuya, Shinji Otake, Kentaro Muraoka, Kimito Osaka, Narihiko Hayashi, Kazuhide Makiyama, Yasuhide Miyoshi, Keiichi Kondo, Noboru Nakaigawa, Takashi Kawahara, Koji Izumi, Junichi Teranishi, Yasushi Yumura, Hiroji Uemura, Yoji Nagashima, Adam R Metwalli, Laura S Schmidt,
  • Journal Title: Human molecular genetics Volume: 印刷中 Issue: 15 Pages: 2712-2724
  • DOI: 10.1093/hmg/ddy181
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Splice-site mutation causing partial retention of intron in the FLCN gene in Birt-Hogg-Dubé syndrome : a case report (2018)
  • Author(s): Mitsuko Furuya, Hironori Kobayashi, Masaya Baba, Takaaki Ito, Reiko Tanaka, Yukio Nakatani
  • Journal Title: BMC medical genomics Volume: 42 Pages: 42-42
  • DOI: 10.1186/s12920-018-0359-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Metabolic regulation by TFE3 in cell proliferation and differentiation (2019)
  • Author(s): Masaya Baba
  • Organizer: The 2nd KU-KAIST Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular Characteristics of Renal Cell Carcinomas in Patients with Birt-Hogg-Dube Syndrome (2018)
  • Author(s): Mitsuko Furuya, Hasumi Hisashi, Ikuma Kato, Masaya Baba, Yoji Nagashima, Yasuhiro Iribe, Yukio Nakatani, Masahiro Yao
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Genetic, epidemiologic and clinicopathologic studies of Japanese patients with Birt-Hogg-Dube syndrome, 2018 update (2018)
  • Author(s): Yasuhiro Iribe, Masahiro Yao, Yoji Nagashima, Masaya Baba, Yukio Nakatani, Mitsuko Furuya
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Studies to uncover the molecular mechanism for cancer development in Xp11. 2 translocation renal cell carcinoma (2018)
  • Author(s): Masaya Baba, Wenjaun Ma, Takanobu Motoshima, Yorifumi Satou, Hisashi Hasumi, Tsuyoshi Kadomatsu, Mitsuko Furuya, Yoji Nagashima, Masahiro Yao, Masatoshi Eto, W Marston Linehan, Yuichi Oike, Tomomi Kamba
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Novel urinary biomarker for Xp11. 2 translocation renal cell carcinoma (2018)
  • Author(s): Ryoma Kurahashi, Tsuyoshi Kadomatsu, Masaya Baba, Chiaki Hara, Motoyoshi Endo, Yuichi Oike, Tomomi Kamba
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Clinicopathological Analyses of 17 Cases of Xp11Translocation Renal Cell Carcinomas (2018)
  • Author(s): Mitsuko Furuya, Masaya Baba, Ikuma Kato, Tsunenori Kondo, Yoji Nagashima, Takao Kamai, Toshinari Yamasaki, Osamu Ogawa, Koushiro Nishimoto, Masafumi Koyama, Tomomi Kamba, Takanobu Motoshima, Masatoshi Eto
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Regulation of hypoxia response pathway by chimeric TFE3s in Xp11. 2 translocation renal cell carcinoma (2018)
  • Author(s): Wenjuan Ma, Takanobu Motoshima, Yorifumi Satou, Hisashi Hasumi, Tsuyoshi Kadomatsu, Ryoma Kurahashi, Mitsuko Furuya, Masahiro Yao, Laura S Schmidt, W Marston Linehan, Yuichi Oike, Tomomi Kamba, Masaya Baba
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Characterization of chimeric TFE3 transcription factors found in Xp11.2 translocation renal cell carcinoma (2018)
  • Author(s): Takanobu Motoshima, Yorifumi Satou, Paola Miyazato, Hisashi Hasumi, Ying Huang, Tsuyoshi Kadomatsu, Masahiro Yao, Yoji Nagashima, Mitsuko Furuya, Yuchi Oike, Laura S Schmidt, Tomomi Kamba, W Marston Linehan, Masaya Baba
  • Organizer: American Urological Association's 2018 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genetic regulation of RUNX2 induce apoptotic cell death through regulating the expression of SOX2 in CRPC-NE cells (2018)
  • Author(s): Yuki Noguchi, Natsuki Wariishi, Shiina Iwai, Gengo Kashiwazaki, Junichi Taniguchi, Toshikazu Bando, Masaya Baba, Souichi Adachi, Hiroshi Sugiyama, Yasuhiko Kamikubo
  • Organizer: AACR Annual Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] BHD-associated kidney cancer exhibits unique molecular characteristics and a wide variety of mutations in chromatin remodeling genes (2018)
  • Author(s): Ryosuke Jikuya, Mitsuko Furuya, Masaya Baba, Hiroyuki Aburatani, Adam R Metwalli, Laura S Schmidt, W Marston Linehan, Masahiro Yao, Hisashi Hasumi
  • Organizer: AACR Annual Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Xp11.2転座型腎細胞癌で認めるキメラTFE3転写因子の機能解析 （6／ (2018)
  • Author(s): 馬場理也、元島崇信、馬 文娟、蓮見壽史、黄 榮、佐藤賢文、宮里パオラ、長嶋洋治、古屋充子、矢尾正祐、神波大己
  • Organizer: 第106回日本泌尿器科学会総会
• [Remarks] International Research Center for Medical Sciences
  • URL: http://ircms.kumamoto-u.ac.jp/