New development of genome editing technologies and disease models
| Project/Area Number |
18H03974
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo (2019-2020)
Osaka University (2018) |
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Principal Investigator |
真下 知士 東京大学, 医科学研究所, 教授 (80397554)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 講師 (50709813)
鈴木 啓一郎 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (70433654)
中田 慎一郎 大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥43,810,000 (Direct Cost: ¥33,700,000、Indirect Cost: ¥10,110,000)
Fiscal Year 2020: ¥12,870,000 (Direct Cost: ¥9,900,000、Indirect Cost: ¥2,970,000)
Fiscal Year 2019: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
Fiscal Year 2018: ¥9,490,000 (Direct Cost: ¥7,300,000、Indirect Cost: ¥2,190,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas / 培養細胞 / 受精卵 / オフターゲット / 診断薬 / CRISPR-Cas3 / 疾患モデル / DNA修復 / CRISPR/Cas / マウス受精卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR-Cas9を利用することで培養細胞やモデル動物において効率的に遺伝子改変ができるようになったが、未だオフターゲット変異などの安全性や特許紛争などの課題がある。本研究では、新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を用いることで、哺乳動物培養細胞および実験動物受精卵での効率的なゲノム編集法を確立することが目的である。さらに、このゲノム編集技術CRISPR-Cas3によるDNA切断、およびDNA修復メカニズムを解明することで、ゲノム編集の効率化およびオフターゲット変異の評価等を行う。最後に、確立した新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を利用して、血友病および筋ジストロフィーのex vivo治療、in vivo治療モデルを開発する。本研究により、新しいヒト疾患モデル動物の開発、および新たなゲノム編集治療における革新的基盤技術の開発を目指している。
これまでの研究成果は、論文として取りまとめて投稿している。関連する研究内容を査読付き英文論文6編、国内図書4編に取りまとめた。CRISPR-Cas3による新しい診断法については特許出願を行った。その他、招待講演として国際2回、国内10回の講演を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、以下の研究を実施した。
①CRISPR-Cas3タンパク質によるDNA切断；大腸菌CRISPR-Cas3システムからタンパク質を精製して、試験管内でのDNA切断を確認した。Cas3の特異的な二本鎖DNA切断の際に、非特異的な一本鎖DNA切断が起こることを新たに発見し、この技術を用いて新型コロナなど新興感染症に対する迅速診断薬への利用の可能性を示した。
②ヒト培養細胞、動物受精卵におけるゲノム編集：ヒトHEK細胞、ヒトiPS細胞において、CRISPR-Cas3による最適なゲノム編集プロトコールを確立した。10-20の複数遺伝子、プロモーター、リピート配列等を対象にゲノム編集を行った。PAM配列、ミスマッチ配列については、SSA解析により特異度を判定した。プラスミドおよび一本鎖DNAを用いて、一塩基置換やGFP等のノックインを実施した。
③CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明、オフターゲット評価：CRISPR-Cas3によるDNA二本鎖切断およびDNA修復メカニズムの解明を検討した。DNA修復因子の検索、ChIP-seqによる発現解析を行った。コンピューターによるcrRNAデザイン、オフターゲット検索プログラムを開発した。CRISPR-Cas9と比較しながら全ゲノムシークエンスによるオフターゲット解析を実施した。以上の結果を取り纏め、オープンアクセス誌Nat Communicationsから公開した。
以上のことから、平成30年度、令和1年度開始当初の研究計画に一部の変更はあったものの、おおむね順調に進展していると自己評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、令和2年度、令和3年度は引き続き、以下の研究を実施する。
①CRISPR-Cas3タンパク質によるDNA切断：令和1年度に新たに発見したCRISPR-Cas3による非特異的一本鎖DNA切断技術を用いて、新型コロナなど新興感染症に対する迅速診断薬の開発を実施する。
②ヒト・動物細胞におけるゲノム編集：マウス・ラット受精卵において、CRISPR-Cas3によるゲノム編集を実現させる。インジェクション条件、濃度、タイミング等の検討を行い、オフターゲット変異解析やゲノム編集効率の向上を目指す。
③CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明：Cas3タンパク質にによるゲノム編集、高速原子力顕微鏡AFMによるDNA二本鎖切断の可視化、DNA修復因子の同定等を行うことで、CRISPR-Cas3によるDNA二本鎖切断およびDNA修復メカニズムを解明する。
④CRISPR/Cas3システムによるゲノム編集モデル動物の作成：CRISPR-Cas3によるヒト疾患モデル動物の開発を実施する。CRISPR-Cas3発現マウスにおけるin vivoゲノム編集治療モデルの開発も検討する。
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Report
(2 results)
Research Products
(50 results)
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[Journal Article] Ubiquitination of DNA Damage-Stalled RNAPII Promotes Transcription-Coupled Repair.2020
Author(s)
Nakazawa Y, Hara Y, Oka Y, Komine O, van den Heuvel D, Guo C, Daigaku Y, Isono M, He Y, Shimada M, Kato K, Jia N, Hashimoto S, Kotani Y, Miyoshi Y, Tanaka M, Sobue A, Mitsutake N, Suganami T, Masuda A, Ohno K, Nakada S, Mashimo T, Yamanaka K, Luijsterburg MS, Ogi T
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Journal Title
Cell
Volume: 19
Pages: 1228-1244
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Pathological characteristics of <i>Ccdc85c</i> knockout rats: a rat model of genetic hydrocephalus2020
Author(s)
Konishi S, Tanaka N, Mashimo T, Yamamoto T, Sakuma T, Kaneko T, Tanaka M, Izawa T, Yamate J, Kuwamura M
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Journal Title
Exp. Anim.
Volume: 69
Issue: 1
Pages: 26-33
DOI
NAID
ISSN
1341-1357, 1881-7122
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] CLICK: one-step generation of conditional knockout mice2018
Author(s)
Miyasaka Y, Uno Y, Yoshimi K, Kunihiro Y, Yoshimura T, Tanaka T, Ishikubo H, Hiraoka Y, Takemoto N, Tanaka T, Ooguchi Y, Skehel P, Aida T, Takeda J, Mashimo T.
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Journal Title
BMC Genomics
Volume: 19
Pages: 000-000
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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