Ｉｎ ｖｉｔｒｏ卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明

• Project/Area Number: 18J01481
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Animal production science
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 佐々木 恵亮 東京農業大学, 生命科学部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 卵母細胞 / ゲノム編集 / microRNA / RNAi / エピジェネティクス / ヒストン修飾 / ゲノムインプリンティング / レンチウイルス / 卵 / 卵巣培養

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、これまでに確立した卵特異的遺伝子ノックダウンシステムの作用機序についてより詳細な解析を進めたとともに、卵形成におけるヒストン脱メチル化酵素の包括的な阻害による影響を調べた。
1) 人工microRNAによる卵特異的遺伝子ノックダウン：前年度までに、卵母細胞で発現するZp3遺伝子のイントロンに人工的に配列を設計したmicroRNA様配列(amiRNA)を挿入することで、成長期以降の卵母細胞に特異的な遺伝子ノックダウン効果が得られることがわかった。本年度は、ノックダウンマウスの様々なステージの卵母細胞における外来amiRNA発現プロファイルを明らかにした。また、内在性遺伝子を標的とした場合のノックダウン効果の検証を行ったことで、本システムによるノックダウン効果はamiRNA転写のホスト遺伝子Zp3と標的となる内在性遺伝子の新規転写が起こるタイミングの同期性が重要であると考えられた。本研究成果を学術論文として発表した。
2) 卵成長過程におけるヒストンH3K4脱メチル化遺伝子の多重阻害：ゲノムインプリンティングの確立に重要なヒストンH3における4番目のリジン(H3K4)の脱メチル化現象に着目し、卵母細胞で発現するH3K4脱メチル化酵素遺伝子群Kdmファミリーをin vitroで多重に阻害した。1)で利用したamiRNAをポリシストロニックに連結することで最大10個のamiRNAを単一の転写ユニットから発現できる系を構築し、このコンストラクトをインプリント確立前の卵母細胞に顕微操作により導入して成長完了卵を得た。その結果、機能既知のKdm1aやKdm1bだけでなく、機能未知のKdm遺伝子群も卵におけるH3K4脱メチル化に関与することがわかった。今後これら機能未知のKdm遺伝子群がインプリント領域を直接的に制御するのかを検証する必要がある。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Oocyte-specific gene knockdown by intronic artificial microRNAs driven by <i>Zp3</i> transcription in mice (2021)
  • Author(s): Sasaki K, Takaoka S, Obata Y
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 67 Issue: 3 Pages: 229-234
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-146
  • NAID: 130008055064
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ectopic expression of DNA methyltransferases DNMT3A2 and DNMT3L leads to aberrant hypermethylation and postnatal lethality in mice (2019)
  • Author(s): Sasaki Keisuke、Hara Satoshi、Yamakami Reina、Sato Yusuke、Hasegawa Saki、Kono Tomohiro、Morohaku Kanako、Obata Yayoi
  • Journal Title: Molecular Reproduction and Development Volume: 印刷中 Issue: 6 Pages: 614-623
  • DOI: 10.1002/mrd.23137
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 卵母細胞特異的ノックダウンシステムの確立 (2019)
  • Author(s): 佐々木恵亮、高岡沙綾、尾畑やよい
  • Organizer: 第112回日本繁殖生物学会大会
• [Presentation] 卵母細胞特異的遺伝子ノックダウンシステムの開発 (2019)
  • Author(s): 佐々木恵亮、尾畑やよい
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会フォーラム「有性生殖における染色体・クロマチン・核動態」