超微量タンパク質絶対定量法によるがん関連シグナル伝達系の包括的プロファイリング

• Project/Area Number: 18J01791
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: System genome science
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 益田 恵子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 無細胞タンパク質合成 / 質量分析 / 絶対定量

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、多重定量可能に改良したMS-QBiC法を用いて微量且つ大規模な定量解析を行った。代表的なものとして、大腸菌リボソーム30Sサブユニットのストイキオメトリ解析、大腸がんマーカー探索、がん関連受容体型チロシンキナーゼの定量系確立などが挙げられる。一方で、がん関連因子のプロファイリングのためには、タンパク質の発現量の変動のみならず翻訳後修飾による制御を定量化する必要がある。特に、リン酸化はがん関連因子の活性制御に重要な役割を担っていることから、MS-QBiC法におけるリン酸化内部標準ペプチドの調製を目的に、大腸菌由来PUREシステムにリン酸化セリン(Sep)導入系を統合することを試みた。古細菌のSep-tRNA合成系を利用し、終止コドンUAGへの部位特異的Sep導入を行った先行研究に基づき、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、Sep-tRNA^Sepを捕捉するEF-Tuをそれぞれ合成し単離した。次に、PUREシステム中でのSep導入効率を観察するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）をモデル分子として、任意の1アミノ酸を終止コドンに置換した変異体鋳型DNAを複数種類設計した。そして、Sep、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、EF-Tuを任意の量PUREシステムに添加した上で野生型GFPおよび各種変異体GFPを合成し、各蛍光強度をモニタリングした後、ペプチド断片化して質量分析によりGFP合成量およびSep導入効率を解析した。予想に反して、Sep導入因子群の添加によって野生型GFPの蛍光強度が低下し、Sep導入因子群によるタンパク質発現阻害が見られた。また、各種変異体においてもSepの導入は検出されなかった。そのため、各Sep導入因子の最適添加量を検討し、Sep導入率及び収量の向上を試みている。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Reconstituted cell-free protein synthesis using in vitro transcribed tRNAs (2020)
  • Author(s): Hibi Keita、Amikura Kazuaki、Sugiura Naoki、Masuda Keiko、Ohno Satoshi、Yokogawa Takashi、Ueda Takuya、Shimizu Yoshihiro
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 3 Issue: 1 Pages: 350-350
  • DOI: 10.1038/s42003-020-1074-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro reconstitution of functional small ribosomal subunit assembly for comprehensive analysis of ribosomal elements in E. coli (2020)
  • Author(s): Shimojo Masaru、Amikura Kazuaki、Masuda Keiko、Kanamori Takashi、Ueda Takuya、Shimizu Yoshihiro
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 3 Issue: 1 Pages: 142-142
  • DOI: 10.1038/s42003-020-0874-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Absolute and multiplex protein quantification method using cell-free protein synthesis and mass spectrometry (2019)
  • Author(s): Keiko Masuda, Keiko Kasahara, Ryohei Narumi, Yoshihiro Shimizu
  • Organizer: 67th American Society for Mass Spectrometry Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 無細胞合成と質量分析を用いたタンパク質の絶対多重定量法 (2019)
  • Author(s): 益田恵子、笠原桂子、鳴海良平、清水義宏
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2019年大会
• [Presentation] 無細胞合成と質量分析を用いた絶対多重定量法とエンドセリン受容体の定量解析 (2019)
  • Author(s): 益田恵子、仲井宏紀、一色衣香、松浦友亮、清水義宏
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会12.0
• [Presentation] 無細胞合成と質量分析を用いた絶対多重定量法とエンドセリン受容体の定量解析 (2019)
  • Author(s): 益田恵子、仲井宏紀、一色衣香、松浦友亮、清水義宏
  • Organizer: 第14回無細胞生命科学研究会
• [Presentation] 無細胞合成と質量分析を用いたタンパク質の絶対多重定量法 (2018)
  • Author(s): 益田恵子、笠原桂子、鳴海良平、清水義宏
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会11.0
• [Presentation] 無細胞合成と質量分析を用いたタンパク質の絶対多重定量法 (2018)
  • Author(s): 益田恵子、笠原桂子、鳴海良平、清水義宏
  • Organizer: 第13回無細胞生命科学研究会