プロテオミクス／ゲノミクススクリーニング法を用いたＳＡＭＤ９分子機構の解明

• Project/Area Number: 18J21048
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Endocrinology
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中尾 佳奈子 東北大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2020: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2019: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2018: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 近接性ラベリング解析 / TurboID / 上流調節因子の同定 / 患者由来細胞を用いたゲノミクス解析 / 結合因子の同定 / 生物学的パスウェイの同定

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、プロテオミクススクリーニングの新たな取り組みとして、近接性ラベリング解析により、SAMD9の相互作用分子の同定を試みた。まずSAMD9のＣ端にTurboIDを融合させたタンパク質をドキシサイクリン誘導性に安定発現するHEK293細胞を作製した。SAMD9は野生型のほか、複数家系のMIRAGE症候群患者で同定したR459Q変異を作製した。コントロールには核外搬出シグナル（NES）とTurboIDの融合タンパク質を使用した。3種の細胞株をビオチン0.5 mMを含む培地で1.5時間培養したのち、RIPAバッファーでライセートを調整した。その後、ストレプトアビジンビーズを用いてビオチン化タンパク質を捕捉し、Q-Exactive HFによる定量的プロテオミクス解析に供した。なお、実験手技に伴うばらつきを評価するため、野生型SAMD9とNESはduplicateで行った。得られた解析データから低カウント分子を除外したのち、まずduplicate間での相関を評価したところ、極めて良好な相関を示した。次に、野生型とNLSおよび野生型SAMD9と変異体SAMD9間での比較をGene Ontology解析およびネットワーク解析で行った。その結果、いくつかSAMD9の機能に関連する可能性がある分子が同定された。その一方で、SAMD9は細胞質に局在するタンパク質であるにも関わらず、野生型SAMD9の近傍分子として核内タンパク質がエンリッチされていおり、偽陽性と考えられた。原因として、ライセートの調整中に核内から出てきた核内タンパク質にTurboIDがビオチンを付加してしまっている可能性が疑われた。現在、この問題点に対処するため、細胞質画分だけを抽出することで、ライセート中での核内タンパク質との接触を避け、再実験を行う方向で準備を進めている。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Prevalence of germline GATA2 and SAMD9/9L variants in paediatric haematological disorders with monosomy 7 (2020)
  • Author(s): Yoshida, M. Tanase-Nakao, K. Shima, H. Shirai, R. Yoshida, K. Osumi, T. Deguchi, T. Mori, M. Arakawa, Y. Takagi, M. Miyamura, T. Sakaguchi, K. Toyoda, H. Ishida, H. Sakata, N. Imamura, T. Kawahara, Y. Morimoto, A. Koike, T. Yagasaki, H. Ito, S. Tomizawa, D. Kiyokawa, N. Narumi, S. Kato, M.
  • Journal Title: British Journal of Haematology Volume: 191 Issue: 5 Pages: 835-843
  • DOI: 10.1111/bjh.17006
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A girl with MIRAGE syndrome who developed steroid-resistant nephrotic syndrome: a case report. (2020)
  • Author(s): Ishiwa S, Kamei K, Tanase-Nakao K, Shibata S, Matsunami K, Takeuchi I, Sato M, Ishikura K, Narumi S.
  • Journal Title: BMC Nephrol. Volume: 12 Issue: 1 Pages: 340-340
  • DOI: 10.1186/s12882-020-02011-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MIRAGE syndrome caused by a novel missense variant (p.Ala1479Ser) in the SAMD9 gene. (2019)
  • Author(s): Onuma S, Wada T, Araki R, Wada K, Tanase-Nakao K, Narumi S, Fukui M, Shoji Y, Etani Y, Ida S, Kawai M.
  • Journal Title: Hum Genome Var. Volume: 7 Issue: 1 Pages: 4-4
  • DOI: 10.1038/s41439-020-0091-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dihydrotestosterone induces minor transcriptional alterations in genital skin fibroblasts of children with and without androgen insensitivity (2019)
  • Author(s): Tanase-Nakao Kanako、Mizuno Kentaro、Hayashi Yutaro、Kojima Yoshiyuki、Hara Mariko、Matsumoto Kenji、Matsubara Yoichi、Igarashi Maki、Miyado Mami、Fukami Maki
  • Journal Title: Endocrine Journal Volume: 66 Issue: 4 Pages: 387-393
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ18-0494
  • NAID: 130007636463
  • ISSN: 0918-8959, 1348-4540
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fetal Goitrous Hypothyroidism and Polyhydramnios in a Patient with Compound Heterozygous DUOXA2 Mutations. (2018)
  • Author(s): Tanase-Nakao K, Miyata I, Terauchi A, Saito M, Wada S, Hasegawa T, Narumi S.
  • Journal Title: Horm Res Paediatr. Volume: 90(2) Issue: 2 Pages: 132-137
  • DOI: 10.1159/000491104
  • Peer Reviewed
• [Presentation] TurboIDによるPAX8近接タンパク質の網羅的解析 (2020)
  • Author(s): 中尾 佳奈子、岩橋 めぐみ、秋葉 和壽、鳴海 覚志
  • Organizer: 第63回日本甲状腺学会学術集会
• [Presentation] SAMD9分子標的療法に向けた構造解析と治療薬スクリーニング系の開発. (2019)
  • Author(s): 中尾佳奈子、伊原健太郎、三嶋千恵美、新野睦子、白水美香子、鳴海覚志
  • Organizer: 第53回日本小児内分泌学会学術集会
• [Presentation] 7番染色体片親性ダイソミーを伴うMIRAGE症候群の2例：予後良好因子としての可能性． (2018)
  • Author(s): 中尾佳奈子、荒木亮佑、和田和子、川井正信、Bernhard Csillag、Denisa Ilencikova、鏡雅代、鳴海覚志
  • Organizer: 第52回日本小児内分泌学会学術集会
• [Presentation] 7番染色体片親性ダイソミーを伴うMIRAGE症候群の2例：予後良好因子としての可能性． (2018)
  • Author(s): 中尾佳奈子、荒木亮佑、和田和子、川井正信、Bernhard Csillag、Denisa Ilencikova、鏡雅代、鳴海覚志
  • Organizer: 第63回人類遺伝学会